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歡迎進入生物課堂 植物組織培養(yǎng)技術 一 實驗目的二 相關知識三 實驗原理四 試劑和器材五 操作步驟六 思考題 目錄 一 實驗目的 掌握植物組織培養(yǎng)相關理論知識掌握植物組織培養(yǎng)的操作方法了解不同激素及其比例對愈傷組織再分化的作用 二 相關知識 離體 invitro 條件下利用人工培養(yǎng)條件在無菌情況下培養(yǎng) 生長 發(fā)育再生出完整植株的過程 1958年 英國科學家Steward等用胡蘿卜根的愈傷組織細胞進行懸浮培養(yǎng) 成功誘導出胚狀體并分化為完整的小植株 不但使細胞全能性理論得到證實 而且為組織培養(yǎng)的技術程序奠定了基礎 應用領域1 快速繁殖運用組織培養(yǎng)的途徑 一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株 例如一株蘭花一年繁殖到400萬株 2 種苗脫毒針對病毒對農(nóng)作物造成的嚴重危害 通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗 3 遠緣雜交利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠緣雜交取得成功 從而育成一些罕見的新物種 二 相關知識 應用領域4 突變育種采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病 抗鹽 高賴氨酸 高蛋白等優(yōu)良性狀的品種 5 基因工程基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導 而基因轉(zhuǎn)導后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株再生 6 生物制品有些極其昂貴的生物制品 如抗癌首選藥物 紫杉醇等 可通過組織培養(yǎng)方式生產(chǎn) 二 相關知識 植物組織培養(yǎng)的分類廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同 可分為 1 器官培養(yǎng) organculture 2 莖尖分生組織培養(yǎng) shoottipculture apicalmeristemculture 3 愈傷組織培養(yǎng) callusecultrue 4 細胞培養(yǎng) cellculture 5 原生質(zhì)體培養(yǎng) protoplastculture 二 相關知識 外植體 explant 由活體 invivo 植物體上提取下來的 接種在培養(yǎng)基上的無菌細胞 組織 器官等 愈傷組織 callus 在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團無序生長狀態(tài)的薄壁細胞 二 相關知識 二 相關知識 二 相關知識 二 相關知識 二 相關知識 二 相關知識 二 相關知識 植物組織培養(yǎng)特點 培養(yǎng)條件可以人為控制 生長周期短 繁殖率高 管理方便 利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制 二 相關知識 植物組織培養(yǎng)營養(yǎng)條件 培養(yǎng)基 CultureMedium 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì) 培養(yǎng)基的成分主要可以分水 無機鹽 有機物 天然復合物 培養(yǎng)體的支持材料等五大類 二 相關知識 國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種 常用的培養(yǎng)基有 MS培養(yǎng)基 B5培養(yǎng)基 White培養(yǎng)基 N6培養(yǎng)基 KM 8P培養(yǎng)基 二 相關知識 常用培養(yǎng)基簡介 MS培養(yǎng)基1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的 特點是無機鹽和離子濃度較高 為較穩(wěn)定的平衡溶液 其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適 可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要 它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高 廣泛地用于植物的器官 花藥 細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng) 效果良好 有些培養(yǎng)基是由它演變而來的 二 相關知識 常用培養(yǎng)基簡介 B5培養(yǎng)基是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的 其主要特點是含有較低的銨 這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用 從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜 如雙子葉植物特別是木本植物 二 相關知識 常用培養(yǎng)基簡介 White培養(yǎng)基是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計的 1963年又作了改良 稱作White改良培養(yǎng)基 提高了MgSO4的濃度和增加了硼素 其特點是無機機鹽數(shù)量較低 適于生根培養(yǎng) 二 相關知識 常用培養(yǎng)基簡介 N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的 其特點是成分較簡單 KNO3和 NH4 2SO4含量高 在國內(nèi)已廣泛應用于小麥 水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng) 二 相關知識 常用培養(yǎng)基簡介 KM 8P培養(yǎng)基1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的 特點是無機鹽和離子濃度較高 為較穩(wěn)定的平衡溶液 其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適 可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要 它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高 廣泛地用于植物的器官 花藥 細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng) 效果良好 有些培養(yǎng)基是由它演變而來的 二 相關知識 不同營養(yǎng)條件對植物組織培養(yǎng)的影響 Growthmediumisoptimisedforregenerationofplantlets Nosucrose 0 Sucrosereducedto1 Sucroseincreasedto5 Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots androotsaredevelopingonthelowersurface Veryfewshootshavedevelopedontheexplant Norootsandnocallus Shootsdevelopedonedgesofuppersurface andsomerootdevelopmenthasoccured Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant alongwithrootsfromthelowersurface Theresultiscomparablewiththecontrolmedium 二 相關知識 NoBAP BAPreducedto0 1mg l 1 NoNAA Poorshootdevelopmentandnoroots Extensivecallusgeneration Poorshootdevelopmentandnoroots NAAreducedto0 1mg l 1 Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots However undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant Profusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant 二 相關知識 NAAincreasedto5 0mg l 1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface andfewshoots Somecallus NoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall MSsaltsreducedto0 47g l 1Somerootgrowthbutreduceddevelopmentofshoots MSsaltsincreasedto9 52g l 1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant Norootsorcallus 二 相關知識 植物細胞的全能性 植物細胞具有該植物體全部遺傳的可能性 在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力 差異 1 受精卵的全能性最高 2 受精卵分化后的細胞中 體細胞的全能性比生殖細胞的低 潛在全能性的原因 基因表達的選擇性科學研究表明 處于離體狀態(tài)的植物活細胞 在一定的營養(yǎng)物質(zhì) 激素和其他外界條件的作用下 就可能表現(xiàn)出全能性 發(fā)育成完整的植株 人工條件下實現(xiàn)的這一過程 就是植物組織培養(yǎng) 三 實驗原理 植物細胞全能性的表達 脫分化 dedifferentiation 將來自已分化組織的已停止分裂的細胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來 恢復細胞的分裂活性 再分化 redifferentiation 經(jīng)脫分化的組織或細胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細胞類型的能力 三 實驗原理 四 試劑和器材 1 材料新鮮胡蘿卜莖2 試劑MS培養(yǎng)基10 亞硫酸溶液 MS培養(yǎng)基配制方法 四 試劑和器材 四 試劑和器材 3 儀器高壓滅菌鍋 超凈工作臺 烘箱 培養(yǎng)箱4 玻璃器皿試劑瓶 50 100 1000ml 三角瓶 100ml 刻度吸管 0 5 1 5 10ml 培養(yǎng)皿5 用具鑷子 解剖刀 接種針 記號筆 封口膜 離體的植物器官 組織 細胞 脫分化 愈傷組織 再分化 根芽 植物體 五 操作步驟 切開胡蘿卜 在圓圈處取一塊組織P 木質(zhì)部 C 形成層 X 韌皮部 五 操作步驟 形成層開始形成愈傷組織C1 愈傷組織 C2 形成層 五 操作步驟 3 4周后完全形成愈傷組織狀態(tài) 脫分化 組織塊失去色素 五 操作步驟 把脫分化后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上 五 操作步驟 兩周左右開始再分化 長出幼苗 五 操作步驟 將幼苗移植到外部條件下培養(yǎng) 順化 五 操作步驟 順化一個月后的胡蘿卜植株 五 操作步驟 培養(yǎng)基配制 I 母液配制 按照MS培養(yǎng)基成分表 配制分別配制培養(yǎng)基的母液 1 大量元素母液 10倍液 分別稱取10倍用量的各種大量無機鹽 依次溶解于大約800ml熱的 60 80 蒸餾水中 一種成分完全溶解后再加入下一種 最后加水 定容至1000ml后裝入試劑瓶中 冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?五 操作步驟 2 微量元素母液 100倍液 分別稱取100倍用量的微量無機鹽 依次溶解于800ml重蒸水中 加水定溶到1000ml 3 鐵鹽母液 100倍液 稱取100倍用量的Na2 EDTA 乙二胺四乙酸鈉 和FeSO4 7H2O 溶于800ml重蒸水中 最后定容到1000ml 五 操作步驟 培養(yǎng)基配制 I 母液配制 4 有機物質(zhì)母液 100倍數(shù) 分別稱取50倍用量的各種有機物質(zhì) 依次溶解于400ml重蒸水中 定容至1000ml 裝入棕色試劑瓶中 貯存冰箱備用 除上述四種母液外 培養(yǎng)基中經(jīng)常附加的各種生物素和細胞分裂素也要配成母液貯存 臨用時按濃度定量吸取加入 五 操作步驟 培養(yǎng)基配制 I 母液配制 5 生長素如2 4 D IAA NAA等 準確稱取20mg 先用2ml95 乙醇溶解 然后加水 定容至20ml 濃度為1mg ml 再放置冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?6 細胞分裂素如激動素 Kt 6 芐基嘌呤 6 BA 準確稱取20mg 先用2ml的1mol mlHCL或NaOH溶解 然后加水 定容至20ml 濃度為1mg ml 再放置冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?五 操作步驟 培養(yǎng)基配制 I 母液配制 取1000ml燒杯一只 加大量元素10倍母液100ml 微量元素100倍母液10ml 鐵鹽100倍母液10ml 有機物質(zhì)100倍母液10ml 此外 根據(jù)培養(yǎng)材料和實驗目的還要附加一定量的生長素 細胞分裂素及蔗糖等 然后加水至1000ml 待蔗糖充分溶解后用1mol L的NaOH或HCl調(diào)酸堿度為pH5 8 最后加入瓊脂粉6 5g 如用瓊脂條 則要加8g 五 操作步驟 培養(yǎng)基配制 II 配制與分裝 將盛有培養(yǎng)基的燒杯在電磁爐上 煮至瓊脂完全融化 補加蒸餾水至1000ml 將配制好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)用三角瓶中 每只100ml三角瓶約裝40ml培養(yǎng)基 分裝時要避免把培養(yǎng)基倒在瓶口上 否則培養(yǎng)時容易引起雜菌污染 五 操作步驟 培養(yǎng)基配制 II 配制與分裝 1 把裝好的培養(yǎng)基的三角瓶放入高壓滅菌鍋中 蓋好鍋蓋 2 設置滅菌參數(shù)為121 20min 開始滅菌 五 操作步驟 培養(yǎng)基配制 III 滅菌 1 取新鮮胡蘿卜莖 用去離子水洗凈 2 在胡蘿卜莖上切一塊含有形成層的組織 放入磨口三角瓶中 倒入適量10 亞硫酸溶液 輕輕搖動15 30s 3 倒去亞硫酸溶液 無菌水洗滌3 4次 徹底清除殘留葉面和瓶內(nèi)的亞硫酸溶液 五 操作步驟 胡蘿卜的取材與處理 1 先用肥皂洗手 穿上工作服 戴上口罩和工作帽 2 放入培養(yǎng)瓶和滅菌后的接種用具 鑷子 解剖刀 接種針 把鑷子 解剖刀 接種針插入內(nèi)盛70 酒精的廣口瓶中 3 用鑷子把胡蘿卜夾入培養(yǎng)皿內(nèi)的吸水紙上 吸干水珠 把胡蘿卜切成含有 木質(zhì)部 形成層 和 韌皮部 三部分的小塊 五 操作步驟 接種 4 小心打開三角瓶 把組織塊投入瓶內(nèi) 用接種針撥勻 蓋上封口膜 5 用記號筆在瓶壁上寫明培養(yǎng)材料 培養(yǎng)基代號 接種日期 五 操作步驟 接種 注意事項 全部接種操作都是在無菌條件下進行的 所以要特別認真仔細 以防雜菌污染 接種完畢后 取出培養(yǎng)瓶中 置于26 28 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 觀察記錄生長情況 并照相存檔 五 操作步驟 培養(yǎng) 1 植物組織培養(yǎng)技術有哪些實際用途 2 植物激素與器官分化有何關系 3 怎樣理解在中藥提取活性成分時要把握好藥材的采收時間 4 為保證無菌 操作時有哪些注意事項 六 思考題 結束 同學們 來學校和回家的路上要注意安全 同學們 來學校和回家的路上要注意安全