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______________________________________________________________________________________________________________ 單克隆抗體制備的基本原理 ?一、單克隆抗體的概念 抗體（antibody）是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對其他無關抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonal antibody），簡稱多抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很大，使它在免疫化學試驗等使用中帶來許多麻煩。因此，制備針對預定抗原的特異性均質(zhì)的且能保證無限量供應的抗體是免疫化學家長期夢寐以求的目標。隨著雜交瘤技術的誕生，這一目標得以實現(xiàn)。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細胞雜交瘤技術，他們把用預定抗原免疫的小鼠脾細胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細胞融合，形成B細胞雜交瘤。這種雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征，既像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單克隆系，即雜交瘤細胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb），簡稱單抗。 與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復性好、且能持續(xù)地無限量供應。單抗技術的問世，不僅帶來了免疫學領域里的一次**，而且它在生物醫(yī)學科學的各個領域獲得極廣泛的應用，促進了眾多學科的發(fā)展。 德國科學家柯勒（Georges Ko1er）和英國科學家米爾斯坦（Cesar Milstein）兩人由此杰出貢獻而榮獲1984年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。 二、雜交瘤技術 （一）雜交瘤技術的誕生 淋巴細胞雜交瘤技術的誕生是幾十年來免疫學在理論和技術兩方面發(fā)展的必然結果，抗體生成的克隆選擇學說、抗體基因的研究、抗體結構與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機制的揭示等，為雜交瘤技術提供了必要理論基礎，同時，骨髓瘤細胞的體外培養(yǎng)、細胞融合與雜交細胞的篩選等提供了技術貯備。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國《自然》雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預定特異性抗體的融合細胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤細胞與經(jīng)綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合。融合由仙臺病毒介導，雜交細胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養(yǎng)基（HAT）中生長進行選擇。在融合后的細胞群體里，盡管未融合的正常脾細胞和相互融合的脾細胞是HGPRT+，但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞因得到分別來自親本脾細胞的HGPRT和親本骨髓瘤細胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。實驗的結果完全像起始設計的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細胞抗體的克隆化雜交瘤細胞系。用這些細胞系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。 這一技術建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細胞系等方面即得到改進。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應用。隨后建立的骨髓瘤細胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細胞系，只分泌一種針對預定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細胞MOPC-21等的不足。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細胞融合的骨髓瘤細胞系，但其基本原理和方法是一樣的。 ? （二）雜交瘤技術的基本原理 細胞融合是一個隨機的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸中，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)，如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。在細胞融合后，要從上述五種細胞中篩選出雜交瘤細胞，一般使用HAT培養(yǎng)進行篩選，HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。細胞的DNA合成有內(nèi)源性途徑(主要途徑)和外源性途徑(旁路途徑)兩種方式。內(nèi)源性途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶的催化下來合成DNA；而外源性途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下來補救合成DNA，HAT培養(yǎng)基中氯基喋呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑, 能有效地阻斷DNA合成的內(nèi)源性途徑。B淋巴細胞具有HGPRTTK這兩種酶, 因此在內(nèi)源性途徑被阻斷后仍能利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶來合成DNA，可在HAT培養(yǎng)基中存活, 但B淋巴細胞是正常細胞, 故不能長期存活。雜交瘤技術中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞為HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能進行DNA的外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。雜交瘤細胞由于繼承了B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的雙重特性，能夠合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT養(yǎng)基中能長期存活。因此將融合后的混合細胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，只有雜交瘤細胞能存活下來，成為制造單克隆抗體的細胞源。 ? 三、單克隆抗體制備的方法與步驟 （一）單抗制備的基本流程 單克隆抗體制備的主要步驟有：①正常小鼠免疫處理；②用物理、化學和生物方法促使細胞融合；③雜交瘤細胞的篩選與培養(yǎng)；④單克隆抗體的提純。 （二）單克隆抗體制備的基本方法 抗原提純與動物免疫　　 對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細胞抗原，可取1×107個細胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖杓油耆Ｊ献魟┎⒔?jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫?！　? 選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，雌雄不限。為避免小鼠反應而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫3～4只小鼠?！　? 免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為最終目的。免疫間隔一般2～3周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產(chǎn)生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關。末次免疫后3～4天，分離脾細胞融合?！　? 骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備　　 選擇瘤細胞株的最重要的一點是與待融合的B細胞同源。如待融合的是脾細胞，各種骨髓瘤細胞株均可應用，但應用最多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細胞的最高生長刻度為9×105/ml，倍增時間通常為10～15h。融合細胞應選擇處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)和活性佳的細胞（活性應大于95％）。骨髓瘤細胞株在融合前應先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應培養(yǎng)，在細胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為2105/ml，次日一般即為對數(shù)生長期細胞?！　? 在體外培養(yǎng)條件下，細胞的生長依賴適當?shù)募毎芏?，因而，在培養(yǎng)融合細胞或細胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細胞（feedercell）。常用的飼養(yǎng)細胞為小鼠的腹腔細胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細胞，其中在巨噬細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞作為飼養(yǎng)細胞的。 在制備飼養(yǎng)細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會有嚴重污染。飼養(yǎng)細胞調(diào)至1×105/ml，提前一天或當天置板孔中培養(yǎng)?！　? 細胞融合　　 細胞融合是雜交瘤技術的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后吧培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有幾個問題應特別注意。①細胞比例：骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。②反應時間：在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分：對融合細胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴格配制。如融合效率降低，應隨時核查培養(yǎng)基情況?！　? 有限稀釋法　　 篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株，所以只有融合的細胞才能待續(xù)存活一周以上。融合細胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個細胞/ 孔），按Poisson法計算，應有36％的孔為1個細胞/孔。細胞培養(yǎng)至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾后進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養(yǎng)或凍存?！　? 單克隆抗體的制備和凍存　　 篩選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c 小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集 5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細胞的數(shù)量應適當，一般為5×105/鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當增減?！　? 選出的陽性細胞株應及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應用的凍存保護劑。凍存細胞復蘇后的活性多在50％～95％之間。如果低于50％，則說明凍存復蘇過程有問題?！　? 單克隆抗體的純化 單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體（最常用Sepharose）交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結合后洗脫，回收率可達90％以上。蛋白可與IgG1、 IgG2a、IgG2b和IgG3結合，同時還結合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm 時，1.44（吸光單位）相當于1mg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預置中和液或速加中和液對保持純化抗體的活性至關重要。 -可編輯修改-