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羊水細胞等貼壁細胞培養(yǎng)及其染色體制作技術與原理,動物細胞培養(yǎng),細胞培養(yǎng)方式大致可分為兩種： 一種是群體培養(yǎng)（mass culture），將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層； 另一種是克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經(jīng)過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克?。╟lone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。 此外，為了制取細胞產(chǎn)品而設計了轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法，使用大容量的圓培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)過程中不斷地轉(zhuǎn)動，使培養(yǎng)的細胞始終處于懸浮狀態(tài)之中而不貼壁。,群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）,細胞培養(yǎng)基本條件,1、合適的細胞培養(yǎng)基 合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng) 和促使細胞生長增殖的基礎物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。,2、優(yōu)質(zhì)血清 目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。,3、無菌無毒細胞培養(yǎng)環(huán)境 無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導致細胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細胞時，必須保持細胞生存環(huán)境無菌無毒，及時清除細胞代謝產(chǎn)物。,4、恒定的細胞生長溫度 維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。 5、合適的氣體環(huán)境 氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。,正常細胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成。此細胞系一直延用至今。,原代培養(yǎng) （primary culture）：從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。原代培養(yǎng)的細胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長，需要從更換培養(yǎng)基。將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。 細胞株（cell strain）：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。,細胞系（cell line）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖 克隆（clone）：亦稱無性繁殖系或簡稱無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。,培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程,體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。,每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞特別是正常細胞，在體外的生存也不是無限的，存在著一個發(fā)展過程。所有這一切，使組織細胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點。,所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。 正常細胞培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷以下三個階段： 1．原代培養(yǎng)（Primary Culture）期； 2．傳代期； 3．衰退期。,1．原代培養(yǎng)（Primary Culture）期,也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。 此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。 初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大，多呈二倍體核型。,2．傳代期,初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。 在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。 為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。 一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期,3．衰退期,此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。 在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。,組織培養(yǎng)細胞一代生存期,所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增（Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：,1．潛伏期,細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關。,貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。 細胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細胞，還要經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。 細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。,2．指數(shù)增生期,這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。,指數(shù)增生期是細胞一代中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天，細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。 腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（Piled up）。,3．停滯期（Stagnate Phase）：,細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。 此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。 此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。,細胞培養(yǎng)基應用選擇,選擇培養(yǎng)基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考： (1 ）建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。 (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞。,(3) 根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選 RPMI1640 。 (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。,細胞培養(yǎng)環(huán)境,1、實驗室設計 細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養(yǎng)室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養(yǎng)室的設計原則一般是無菌操作區(qū)設在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。,2、常用設施及設備,（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側流式、直流式和外流式三大類。,（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。 操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物 洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。 分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。,細胞培養(yǎng)無菌操作基本技術,工作環(huán)境的處理 使用層流超凈工作臺是最經(jīng)濟有效的手段。超凈工作臺正常工作時，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進入超凈臺。,（1）實驗前，無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風機運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。實驗結束后，將實驗物品帶出工作臺。如需要繼續(xù)進行下一個實驗，則用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風機運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可進行下一個實驗操作。,（2）無菌操作工作區(qū)域應保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出，以利氣體流通。實驗用品要用70%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。,（3）小心取出無菌實驗用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。,（4）工作人員應注意自身的安全，必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心，并選擇適當?shù)燃壍臒o菌操作臺（至少兩級）。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳物品傷人等。,（5）定期檢查下列項目：CO2 鋼瓶內(nèi)的CO2 壓力；CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染；無菌操作臺內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA 過濾器濾膜，預濾網(wǎng)﹙300 小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA）。,人羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備,人的羊水細胞能長成單層并可連續(xù)進行傳代培養(yǎng)，但它們的一些特征與一般成纖維細胞不同。在羊水中存在著各種不同類型的胎兒細胞，依據(jù)其外形和生長特征可區(qū)分為以下三類：上皮細胞（E）、成纖維細胞（F）和羊水細胞（AF）。,E細胞在胰酶消化的連續(xù)培養(yǎng)中不再生長，所以在培養(yǎng)過程中的生長期最短。 AF細胞在再培養(yǎng)中一開始就長得很好，染色體分析大多用這類細胞。 F細胞在再培養(yǎng)中潛在的生長期最長，在較老的羊水培養(yǎng)物中占優(yōu)勢。,通常在培養(yǎng)后3—4天（可能更早些）即出現(xiàn)E細胞的集落，它們不適合再培養(yǎng)作染色體分析。大約在第7天出現(xiàn)的AF細胞可被用于染色體制備。如果在培養(yǎng)后第10天還未見長出新的細胞，就應考慮第二次羊膜穿刺。,實驗用品、實驗試劑,見實驗操作手冊,內(nèi)容與方法,（一）細胞接種與培養(yǎng) 在無菌條件下抽得妊娠18-22周羊水后，注入10ml離心管中，共抽4管約32ml，立即送檢 進室后，以1500rpm離心10min 進無菌室，在無菌操作臺上吸去上清液，每管約留0.5ml，吸管打散細胞。制成細胞懸液，再加入約4.5ml完全培養(yǎng)基入管內(nèi)，吸管輕混勻，移至25cm2方形培養(yǎng)瓶中置含5%CO2的37℃溫箱行開放式培養(yǎng),一般5天后鏡下觀察，可見成纖維樣或上皮細胞生長，當細胞生長旺盛，在貼壁細胞層的背景上出現(xiàn)圓形細胞時，視情況（有較好的梭形細胞克隆）可換上換液用培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，如細胞生長狀況好，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml, (20ug/ml，7號針頭垂直加2滴)4-6小時左右行細胞學處理,（二）細胞收獲 倒出瓶中細胞液入10ml離心管，0.85%NaCl沖洗細胞壁兩遍 0.25% EDTA-trypsin消化3-5分鐘，待細胞面出現(xiàn)肉眼可見皺形改變時即用吸管吹打細胞。 收集細胞懸液：離心，1500rpm，10min，去上清,低滲：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%檸檬酸鈉1∶1作為低滲液,每管8ml，低滲10min)。 預固定：加入1.5ml左右，輕混勻37℃水浴5min， 離心,1500rpm,10min。 固定：加入3:1固定劑8ml左右，輕混勻，37℃水浴10min,室溫1500rpm離心10min，去上清，約留0.5ml 重復固定：同上 離心，1500rpm，10min，去上清 調(diào)懸液：視管底細胞量加入幾滴新鮮固定劑，并吹打混勻,滴片：每片1-2滴, 滴片4-6張 烤片：75℃烤箱烘烤3小時 第二天行顯帶處理：同外周血,注意事項,羊水標本應及時送檢，送檢過程中不宜受熱或冰凍，實驗人員收到羊水后應先觀察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否為血性羊水；羊水中少量紅細胞不需處理,如有明顯血性羊水,立即在羊水中加入無菌肝素一滴。,接種所用器皿要進行嚴格的滅菌處理。 離心時，一定要注意離心機內(nèi)溫度，必須達到室溫方可離心。 培養(yǎng)基pH為7.2-7.4也是羊水細胞開放式培養(yǎng)成功的關鍵。 注意接種時培養(yǎng)基不能加得過多，臥倒瓶子時，培養(yǎng)基不能接觸瓶蓋；,羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基 傳統(tǒng)的培養(yǎng)基是在F10中加入一定比例的胎牛血清,由于營養(yǎng)成份較少,羊水細胞培養(yǎng)所需時間較長,培養(yǎng)成功率低。 國內(nèi)有些學者通過添加生長因子或用血清代用品來培養(yǎng)羊水,但步驟繁瑣,也容易造成污染。,要根據(jù)細胞的生長狀況，來決定所要收獲的時間。 抓住細胞生長旺盛時期相當重要，如羊水為血性羊水或胎質(zhì)較多須給予不同的處理。 要收獲較多的分裂相,必須在適當?shù)臅r機收獲。,收獲標準：于10倍目鏡和4倍物鏡下觀察: ①以梭長形羊水細胞(AF細胞)為主要類型的生長細胞,形成的細胞克隆覆蓋1個或1個以上的完整視野。 ②培養(yǎng)瓶中有2～3個以上細胞克隆,且每個細胞克隆中存在有20個以上的圓形、雙圓形或葡萄狀透亮細胞。 ③細胞克隆中央的細胞開始老化,克隆周邊細胞生長旺盛。,收獲細胞時要掌握好低滲時間及低滲液的量，吹打時力度要均勻，滴片濃度不能太高，以免細胞不分散。培養(yǎng)收獲時間大多數(shù)為9～10天,最早收獲在第7天,最長14天。顯帶時，胰酶消化時間一般比外周血要稍長，但需根據(jù)其胰酶活性而定。,絨毛細胞培養(yǎng)與染色體制備,絨毛細胞由受精卵發(fā)育分化的滋養(yǎng)層細胞及絨毛間質(zhì)中的胚外中胚層細胞組成，絨毛細胞與胎兒組織同源，通過絨毛檢測，可客觀反映胎兒情況。絨毛既可以直接制片進行染色體的觀察，也可以經(jīng)培養(yǎng)制備染色體，進行產(chǎn)前診斷。,內(nèi)容與方法,挑選孕6-8周孕婦，詢問病史、進行婦科檢查，以確定早孕，了解子宮大小，位置、彎曲情況及胚胎著床情況 拭去宮頸粘液，嚴密消毒宮頸及宮頸管下段，一般可不用宮頸鉗，如子宮過度前屈或后屈，則有助手用宮頸鉗輕拉子宮向下固定,用消毒塑料吸管按子宮的自然彎曲方向，沿著子宮壁輕輕進入子宮腔，直至有阻力感為止，一般進入子宮頸外口6-10cm（根據(jù)妊娠天數(shù)及宮頸長度而定）切忌反復進退，以防剝離面大，然后用空針抽吸，同時退出塑料管，大多可吸出少許血液，絨毛枝便夾在其中,在無菌條件下，將絨毛組織放入玻璃平皿中，用含400U/ml雙抗的0.85%NaCl反復沖洗絨毛組織2-3次以去除血液，然后除去并吸凈生理鹽水,（一）消化法 （1）經(jīng)低倍鏡下鑒定為絨毛枝后，在玻璃平皿用眼科手術剪將絨毛組織剪碎,放入裝有30-50倍組織量的0.25% EDTA-trypin的三角燒瓶中，37℃下,20-30min即可 (2)將三角燒瓶中的組織溶液裝入離心管，離心,1000rpm,10min,(3)去上清，加入20 ml PBS,打勻 (4)離心,1000rpm,10min (5)去上清，加入20 ml PBS,打勻 (6)細胞計數(shù)：106/25cm2接種,(二)貼壁法 經(jīng)低倍鏡下鑒定為絨毛枝后，在玻璃平皿用眼科手術剪剪成1-2mm3小枝或小塊，移入25cm2培養(yǎng)瓶中，用牙科探針將組織均勻分散于培養(yǎng)瓶的細胞貼壁面，組織塊的間距約為0.5cm-1cm,于對側瓶壁加入含50%血清的培養(yǎng)基，pH為7.2-7.4，37℃培養(yǎng)2-3小時待組織貼壁牢固后，即可翻瓶，使組織塊泡在培養(yǎng)液中,(三)收獲細胞及染色體制片 每天觀察，一般3-7天可見上皮樣或成纖維樣細胞生長。根據(jù)生長情況每隔5-7天換液一次。一般培養(yǎng)6-20天，待細胞生長旺盛時，按下列程序處理：,加入秋水仙素0.02-0.04ug/ml讓其過夜，約14小時左右,或秋水仙素0.04-0.08ug/ml,4-6h收獲 將培養(yǎng)液倒入離心管中，加入PBS或生理鹽水2-3毫升，洗凈完全培養(yǎng)基，加0.25% EDTA-trypsin約2ml消化3-5min，完全培養(yǎng)基終止消化。置離心管中離心，1500rpm ，10min,低滲：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%檸檬酸鈉1∶1作為低滲液,每管8ml，低滲10min) 預固定：加入1.5ml左右，輕混勻37℃水浴3min，離心,1500rpm,10min 固定：加入3:1固定劑8ml左右，輕混勻，37℃水浴15min,室溫1500rpm離心10min，去上清，約留0.5ml 重復固定：同上 離心，1500rpm，10min，去上清 視管底細胞量加入適當幾滴新鮮固定劑,滴片：每片1-2滴, 滴片4-6張 烤片：75℃烤箱烘烤3小時 第二天行顯帶處理：同外周血,注意事項,嚴格無菌操作是培養(yǎng)成功的關鍵； 視細胞分裂旺盛情況加秋水仙素0.2-0.4ug/ml、 4-6小時也可考慮收獲； 在用0.25% EDTA-trypsin消化之前盡量將瓶壁血清洗凈，更有利于快速消化； 低滲之后每一步均應輕吹打，用力過大可能損失掉較多細胞。,Thank you!,