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第十一單元 生物技術實踐 第41講 基因工程,考綱要求 (1)基因工程的誕生(Ⅰ) (2)基因工程的原理及技術(Ⅱ) (3)基因工程的應用(Ⅱ) (4)蛋白質工程(Ⅰ),教材導學 一、基因工程的概念及基本工具,二、基因工程的基本操作程序,三、基因工程的應用,四、蛋白質工程,自我校對 一、DNA重組 體外DNA重組 轉基因 遺傳特性 生物類型 生物產品 限制酶(限制性核酸內切酶) 某種特定核苷酸序列 特定部位的磷酸二酯鍵 黏性末端 平末端 DNA連接酶 磷酸二酯鍵 質粒 小型雙鏈環(huán)狀DNA 限制酶 復制 遺傳標記基因 λ噬菌體的衍生物 二、編碼蛋白質 PCR技術 啟動子 終止子 農桿菌轉化法 顯微注射法 插入了目的基因 轉錄出了mRNA 三、抗病 抗逆 生長速度 品質 藥物 器官移植 四、蛋白質 蛋白質 氨基酸 脫氧核苷酸,考點突破 考點一 基因工程的基本工具 1.限制酶和DNA連接酶的關系 (1)限制酶和DNA連接酶的作用部位都是磷酸二酯鍵。 (2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。 (3)限制酶是一類酶，而不是一種酶。 (4)DNA連接酶起作用時，不需要模板。,(1)一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據不同的目的和需要，對某些天然的載體進行人工改造。 (2)限制酶切割位點所處的位置必須是在所需的標記基因之外，這樣才能保證標記基因的完整性，有利于對目的基因的檢測。,【注意】 (1)在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶，目的是產生相同的黏性末端。 (2)將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產生4個黏性末端。 (3)不同DNA分子用同一種限制酶切割產生的黏性末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產生的黏性末端一般不相同。 (4)限制酶切割位點應位于標記基因之外，不能破壞標記基因，以便進行檢測。,(5)基因工程中的載體與細胞膜上物質運輸的載體不同?；蚬こ讨械妮d體是DNA分子，能將目的基因導入受體細胞內；膜載體是蛋白質，與細胞膜的通透性有關。 (6)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。,【例1】 一環(huán)狀DNA分子，設其長度 為1，已知某種限制性核酸內切酶在該 分子上有3個酶切位點，如圖中A、B、 C三處。如果該DNA分子在3個酶切位 點上都被該酶切斷，則會產生0.2、0.3、 0.5三種不同長度的DNA片段?，F有多 個上述DNA分子，若在每個分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷；則從理論上講，經該酶切后，這些DNA分子最多能產生長度不同的線狀DNA的種類數是 ( ) A.4 B.8 C.6 D.7,【解析】 本題考查限制酶的作用，在此環(huán)狀DNA上可以切1-3個位點，切1個位點得到長度為1的片段，切2個位點可以得到長度為0.5、0.2、0.8、0.3、0.7共5種片段，切3個位點可以得到0.2、0.3、0.5共3種長度的片段，總共能獲得6種不同的DNA片段。 【答案】 C,【例2】 (多選)(2014·廣東)利用基因工程技術生產羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如圖所示，下列敘述正確的是 ( ),A.過程①需使用逆轉錄酶 B.過程②需使用解旋酶和PCR獲取目的基因 C.過程③使用的感受態(tài)細胞可用NaCl溶液制備 D.過程④可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導入受體細胞,【解析】 過程①是以RNA為模板合成DNA的過程，即逆轉錄過程，需要逆轉錄酶的催化，故A項正確；過程②表示利用PCR擴增目的基因，在PCR過程中，不需要解旋酶，是通過控制溫度來達到解旋的目的，故B項錯；利用氯化鈣處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細胞，故C項錯；檢測目的基因是否成功導入受體細胞的染色體DNA中，可以采用DNA分子雜交技術，故D項正確。 【答案】 AD,考點二 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的獲取 (1)從基因文庫中獲取目的基因：如從基因組文庫或cDNA文庫中獲取。 (2)利用PCR技術擴增目的基因：利用DNA復制的原理在體外特異性的復制某DNA片段以獲得呈指數方式增加的目的基因。 (3)人工合成法：通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。,【例3】 如圖表示化學方法合成目的基因Ⅰ的過程。據圖分析下列敘述正確的是 ( ),A.過程①需要DNA連接酶 B.過程②需要限制性核酸內切酶 C.目的基因Ⅰ的堿基序列是已知的 D.若某質粒能與目的基因Ⅰ重組，則該質粒與Ⅰ的堿基序列相同,【解析】 DNA連接酶是將兩個DNA分子的黏性末端或平末端的“縫隙”連接起來，而過程①是兩條鏈的堿基互補配對，不需要DNA連接酶，A項錯誤；限制性核酸內切酶是用來切割DNA的，而過程②不需要，B項錯誤；當某質粒與目的基因用限制酶切割后有互補的黏性末端，就可以形成重組DNA分子，D項錯誤。 【答案】 C,2.基因表達載體的構建 (1)基因表達載體的組成，如圖所示。,(2)基因表達載體的構建方法。,【注意】 (1)插入的目的基因的表達需要調控序列，因而用作載體的質粒的插入基因部位之前需有啟動子，之后需有終止子。 (2)一般情況下，用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的片段，便于連接。但有時可用兩種限制酶分別切割質粒和目的基因，這樣可避免質粒和質粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。,(3)標記基因的種類和作用：標記基因的作用——篩選、檢測目的基因是否導入受體細胞，常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達產物為帶顏色的物質)等。 (4)還應注意的問題有：①基因表達載體中，啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(RNA)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(RNA)。②基因表達載體的構建是最核心、最關鍵的一步，在體外進行。,【例4】 如圖為基因表達載體模式圖，下列相關敘述正確的是 ( ),A.甲表示啟動子，位于基因的首端，它是DNA聚合酶識別、結合的部位 B.乙表示終止密碼子，位于基因的尾端，作用是使轉錄過程停止 C.丙表示目的基因，其作用是獲得人們所需要的性狀 D.復制原點的存在有利于目的基因在宿主細胞中擴增,【解析】 甲表示啟動子，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別、結合的部位，A項錯誤；乙表示終止子，位于基因的尾端，作用是使轉錄過程停止，B項錯誤；丙表示標記基因，其作用是鑒定受體細胞中是否含有目的基因，C項錯誤。 【答案】 D,4.目的基因的檢測和鑒定,【注意】 (1)基因工程操作過程中只有第三步(將目的基因導入受體細胞)沒有發(fā)生堿基互補配對現象。 (2)原核生物作為受體細胞的優(yōu)點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少。 (3)轉化的實質是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。,【例5】 目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是 ( ) ①檢測受體細胞是否有目的基因 ②檢測受體細胞是否有致病基因 ③檢測目的基因是否轉錄出mRNA ④檢測目的基因是否翻譯出蛋白質 A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②④,【解析】 目的基因的檢測包括：檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA分子雜交技術，使DNA探針與基因組DNA雜交；檢測目的基因是否轉錄出了mRNA，方法是用基因探針與mRNA雜交；檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質，方法是進行抗原—抗體雜交。 【答案】 C,【例6】 轉基因生物作為生物反應器，用于生產人們所需要的藥用蛋白，如激素、抗體、疫苗、酶等。下圖是通過生物工程培育能產生人胰島素煙草的過程。請據圖回答：,(1)構建表達載體的A過程中，需要用到的工具酶有______ __和________。 (2)D過程采用的方法是________。若把重組質粒導入動物細胞，常采用的方法是________。 (3)E過程采用的技術主要包括________和________兩個階段。 (4)如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進行檢測，F過程應該用________作為探針。,【解析】 構建表達載體的A過程中，需要用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶。重組質粒導入不同生物的受體細胞方法不同，微生物常用Ca2+處理，植物細胞常用農桿菌轉化法，動物細胞常用顯微注射法。植物組織培養(yǎng)技術的核心是脫分化和再分化。如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進行檢測，F過程應該用放射性同位素標記的胰島素基因作為探針，因為目的基因是胰島素基因。 【答案】 (1)限制酶 DNA連接酶 (2)農桿菌轉化法 顯微注射法 (3)脫分化 再分化 (4)放射性同位素標記的胰島素基因,【例7】 某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋白酶的結構和功能很相似，只是其熱穩(wěn)定性較差，進入人體后容易失效?，F要將此酶開發(fā)成一種片劑，臨床治療食物消化不良，最佳方案是 ( ) A.替換此酶中的少數氨基酸，以改善其功能 B.將此酶與人蛋白酶進行拼接，形成新的蛋白酶 C.重新設計與創(chuàng)造一種蛋白酶 D.減少此酶在片劑中的含量,【解析】 蛋白質的結構包括一級結構和空間結構，一級結構是指組成蛋白質的氨基酸的種類、數量、排列順序，蛋白質的功能是由一級結構和空間結構共同決定的，特別是空間結構與蛋白質的功能關系更密切。要想使蛋白酶熱穩(wěn)定性有所提高，就要改變蛋白質的結構，此類問題一般是對蛋白質中的個別氨基酸進行替換。 【答案】 A,【例8】 干擾素是動物體內合成的一種蛋白質，可以用于治療病毒感染和癌癥，但體外保存相當困難，如果將其分子中的一個半胱氨酸變成絲氨酸，就可以在-70 ℃條件下保存半年，給廣大患者帶來了福音。 (1)蛋白質的合成是受基因控制的，因此獲得能夠控制合成“可以保存的干擾素”的基因是生產的關鍵，依據蛋白質工程原理，設計實驗流程，讓動物生產“可以保存的干擾素”：,(2)基因工程和蛋白質工程相比較，基因工程在原則上只能生產________的蛋白質，不一定符合________的需要。而蛋白質工程是以蛋白質分子的結構及其與生物功能的關系為基礎，通過________或________，對現有蛋白質進行________，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活需要。 (3)蛋白質工程實施的難度很大，原因是蛋白質具有十分復雜的________結構。,(4)對天然蛋白質進行改造，應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現？_________________ ____________。 原因是：______________________________________ ___________________。,【解析】 (1)蛋白質工程的基本流程為：根據預期的蛋白質功能，設計出預期的蛋白質結構，推測應有的氨基酸序列，合成相對應的脫氧核苷酸序列。 (2)蛋白質工程的實質是通過對基因改造或基因合成，制造自然界不存在的、符合人們生產和生活需要的蛋白質。 (3)蛋白質的空間結構十分復雜，很難根據預期功能來預測出空間結構。 (4)基因控制蛋白質的合成，對基因的改造相當于間接改造了蛋白質。,【答案】 (1)預期蛋白質的功能 預期的蛋白質結構 應有的氨基酸序列 相對應的脫氧核苷酸序列(基因) (2)自然界已存在 人類生產和生活 基因修飾 基因合成 改造 (3)空間(或高級) (4)應該通過對基因的操作來實現對天然蛋白質的改造 首先，任何一種天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因也就是改造了蛋白質，并且改造過的蛋白質可以通過改造過的基因遺傳給下一代。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質分子還是無法遺傳；其次，對基因進行改造比對蛋白質直接進行改造要容易操作，難度要小得多,考點四 基因工程的應用 1.乳腺生物反應器與工程菌生產藥物的比較 (1)概念： ①乳腺生物反應器是指將外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產藥物蛋白。 ②工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。,【例9】 下列有關基因診斷和基因治療的敘述，正確的是 ( ) A.基因工程可以直接在細胞內修復有問題的基因 B.用基因替換的方法可治療21-三體綜合征 C.基因治療就是把缺陷基因誘變成正?；?D.應用基因探針可以檢測出苯丙酮尿癥,【解析】 有缺陷的基因不能在細胞內進行修復；21三-體綜合征是染色體疾病，用基因替換沒有治療效果；基因治療是用正?；颉把谏w”缺陷基因；苯丙酮尿癥是基因突變引起的遺傳病，可以通過基因探針檢測出來。 【答案】 D,【例10】 下列關于轉基因動物的描述，不正確的是 ( ) A.可將外源生長激素基因導入動物細胞內，提高動物的生長速率 B.可將腸乳糖酶基因導入奶?；蚪M，降低乳汁中乳糖的含量，進而改善畜產品的品質 C.可利用轉基因技術制成乳腺生物反應器，使哺乳動物的產奶量增加 D.可以利用轉基因動物作為器官移植的供體,【解析】 可利用轉基因技術制成乳腺生物反應器，使哺乳動物本身變成“批量生產藥物的工廠”，選項C錯誤。 【答案】 C,課堂練習 1.下圖是獲得抗蟲棉的技術流程示意圖?？敲顾乜剐曰?kanR)常作為標記基因，只有含卡那霉素抗性基因的細胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長。下列敘述正確的是 ( ),A.構建重組質粒過程中需要限制性內切酶和DNA連接酶 B.愈傷組織的分化產生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kanR)中有該過程所利用的限制性內切酶的識別位點 D.抗蟲棉有性生殖后代能保持抗蟲性狀的穩(wěn)定遺傳,解析 質粒與目的基因結合時需要用同一種限制性內切酶切割，切出的黏性末端相同，可用DNA連接酶連接；愈傷組織由相同的細胞分裂形成，分化后產生相同基因型的植株；卡那霉素抗性基因作為標記基因不能有限制性內切酶的切割位點，標記基因被切斷后就不能再表達，從而失去作用；抗蟲棉為雜合子，其有性生殖后代可能會發(fā)生性狀分離，抗蟲性狀不一定能穩(wěn)定遺傳。 答案 A,2.有關基因工程的敘述正確的是 ( ) A.限制酶只在獲得目的基因時才用 B.重組質粒的形成是在細胞內完成的 C.質粒都可作為運載體 D.蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料,解析 如果以質粒為運載體，首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個切口，露出黏性末端，然后用同一種限制酶切割目的基因，使其產生相同的黏性末端，所以運載體的切割也要用到限制酶，重組質粒的形成是在生物體外完成的。只有具有標記基因的質粒才能作為運載體。 答案 D,3.下圖是將人的生長激素基因導入細菌D細胞內，產生“工程菌”的示意圖。所用的載體為質粒A。若已知細菌D細胞內不含質粒A，也不含質粒A上的基因，質粒A導入細菌后，其上的基因能得到表達。能表明目的基因已與載體結合，并被導入受體細胞的結果是 ( ),A.在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上均能生長繁殖的細菌 B.在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能生長繁殖的細菌 C.在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生長繁殖，但在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長繁殖的細菌 D.在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能生長繁殖，但在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能生長繁殖的細菌,解析 由題圖可知，人生長激素基因插入質粒后將四環(huán)素抗性基因破壞，該基因不再表達。因此，含有重組質粒的受體細胞在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生長繁殖，但在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長繁殖。 答案 C,4.下列關于基因表達載體構建的相關敘述，不正確的是 ( ) A.需要限制酶和DNA連接酶 B.必須在細胞內進行 C.抗生素抗性基因可作為標記基因 D.啟動子位于目的基因的首端,解析 基因表達載體的構建是目的基因與載體結合，在此過程中需用同一種限制酶切割目的基因與載體，用DNA連接酶將相同的末端連接起來；基因表達載體的構建是在細胞外進行的；基因表達載體包括啟動子、目的基因、終止子和標記基因，其中啟動子位于目的基因首端使轉錄開始，終止子在目的基因之后。 答案 B,5.甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基因的兩種方法，以下說法中錯誤的是 ( ),A.甲方法可建立該細菌的基因組文庫 B.乙方法可建立該細菌的cDNA文庫 C.甲方法要以脫氧核苷酸為原料 D.乙方法需要逆轉錄酶參與,解析 首先要知道甲圖描述的為該細菌的基因組文庫，只要利用DNA限制性核酸內切酶將其原有的DNA切斷即可，不需要以脫氧核苷酸為原料。乙圖描述的為細菌的部分基因文庫。乙方法需要逆轉錄酶參與，并需要以脫氧核苷酸為原料。 答案 C,6.在某些深海魚中發(fā)現的抗凍蛋白基因afp 對提高農作物的抗寒能力有較好的應用價值。 下圖所示是獲得轉基因萵苣的技術流程，請 據圖回答下列問題： (1)獲取目的基因的主要途徑包括從自然界已 有的物種中分離和________。 (2)①過程需要的酶有________、________。 (3)重組質粒除了帶有抗凍蛋白基因afp以外， 還必須含有啟動子、終止子和________，這 樣才能構成一個完整的基因表達載體。,(4)如果受體細胞C1是土壤農桿菌，則將目的基因導入它的目的是利用農桿菌的________，使目的基因進入受體細胞C2，并將其插入到受體細胞C2中________上，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達，形成轉基因萵苣。經②過程獲得的轉基因萵苣中的目的基因是否表達，在分子水平上可用________法進行檢測，如果出現雜交帶，說明目的基因已經表達出蛋白質產品，轉基因萵苣培育成功。,解析 (1)獲取目的基因的主要途徑有從自然界已有的物種中分離和人工合成。 (2)①過程為基因表達載體的構建過程，需要用到限制酶和DNA連接酶。 (3)一個完整的基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因。 (4)農桿菌轉化法利用的是農桿菌的轉化作用，將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上，進而使目的基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達。檢測目的基因是否成功表達可采用抗原——抗體雜交法。,答案 (1)(用逆轉錄等方法進行)人工合成 (2)限制酶 DNA連接酶 (3)標記基因 (4)轉化作用 染色體DNA 抗原——抗體雜交,