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單克隆抗體技術(shù),提綱,單克隆抗體的概念 單克隆抗體的制備 單克隆抗體的應(yīng)用,萊克多巴胺單克隆抗體,1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。 每個(gè)B淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對(duì)某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無(wú)限增殖，因此雜交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。 單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點(diǎn)是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。,一、單克隆抗體的概念（monoclonal antibody, McAb）,概念：通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆產(chǎn)生的具有均一性抗體的技術(shù)。 細(xì)胞克?。河梢粋€(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集團(tuán)。,B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對(duì)這種抗原分泌特異性抗體的能力。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞既具有瘤的無(wú)限生長(zhǎng)的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體。,雜交瘤技術(shù),通過(guò)融合經(jīng)過(guò)免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以獲得同時(shí)具有抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性特征的雜交瘤細(xì)胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。,二、單克隆抗體的制備,（一）制備原理： 用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和篩選。 HAT選擇性培養(yǎng)基： 培養(yǎng)基中加次黃嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。,單克隆抗體制備原理,HAT培養(yǎng)基的選擇原理： （1）氨基蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，細(xì)胞在含有氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中不能通過(guò)正常途徑合成DNA。 （2）瘤細(xì)胞是HGPRT酶陰性細(xì)胞，自身不能通過(guò)替代途徑合成DNA而繁殖。 （3）B細(xì)胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養(yǎng)存活（只存活5~7d，且功能下降)。 （4）融合細(xì)胞含有B細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中瘤細(xì)胞核利用B細(xì)胞的HGPRT酶進(jìn)行旁路合成DNA而存活。,單克隆抗體的制備原理,經(jīng)HAT選擇后的各種細(xì)胞的結(jié)果,融合的B細(xì)胞和瘤細(xì)胞; 由于雜交細(xì)胞獲得了： （1）HGPRT、 TK 酶基因并正常表達(dá)、利用培養(yǎng)基中的H、T 合成DNA （2）瘤細(xì)胞的“永生性”而得以存活和無(wú)限擴(kuò)增。 未融合的B細(xì)胞、融合的B細(xì)胞和B細(xì)胞以及B細(xì)胞的多聚體; 因不能正常合成DNA而死亡 未融合的瘤細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、以及瘤細(xì)胞的多聚體等; 因不能正常合成DNA而死亡。,（二）基本制備流程,（三）單克隆抗體的制備步驟,1、免疫原的制備 2、免疫動(dòng)物 3、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 4、細(xì)胞融合 5、雜交瘤細(xì)胞及陽(yáng)性孔的篩選 6、陽(yáng)性孔的特異性檢測(cè)及特異性陽(yáng)性孔的克隆 7、單克隆抗體的制取,1、免疫原的制備,顆粒性抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白等分子量大于5000Da生物物質(zhì)。 可溶性抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于 5000 Da 物質(zhì)。 注意：可溶性抗原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成顆粒性抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價(jià)的抗體。,2、免疫動(dòng)物,（1）動(dòng)物選擇：一般采用與骨髓瘤細(xì)胞供體來(lái)源同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫（如：小鼠）。由于免疫動(dòng)物品系與所采用的骨髓瘤細(xì)胞差異較遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性越差。 （2）抗原與載體：抗原分為可溶性和顆粒性抗原，載體分膜體和珠體。 （3）免疫途徑：較為常用 的途徑有腹腔，皮下淋巴器官或靜脈等，較為常用的途徑是腹腔注射。,2、免疫動(dòng)物,可溶性抗原（蛋白質(zhì)）： 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點(diǎn)小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，10天后，斷尾取血一滴，測(cè)抗體效價(jià)，選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。一個(gè)月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無(wú)佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。 顆粒性抗原 如抗原來(lái)源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時(shí)間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。,為什么要多次免疫小鼠？,正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬(wàn)分之一的機(jī)會(huì)獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機(jī)會(huì)，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。,3. 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,細(xì)胞株處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，本身不能分泌任何抗體或免疫球蛋白； 瘤細(xì)胞的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者組織相容性抗原一致； 細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)或TK缺陷狀態(tài)。,4. 細(xì)胞融合,（1）細(xì)胞融合劑和融合手段 病毒融合：高濃度仙臺(tái)病毒等 化學(xué)融合劑：PEG等 電融合技術(shù)：國(guó)產(chǎn)新芝牌電融合儀 （2）融合技術(shù) 一種是加入融合劑后直接離心使兩種細(xì)胞緊密接觸（R<3000r/min），另一種是加入融合劑后輕輕攪動(dòng)融合。,,（3）提高融合頻率的可能途徑 融合過(guò)程中由于細(xì)胞特性、操作過(guò)程、PEG毒性等多種因素都可能影響融合而減少融合頻率。 方法：對(duì)親本細(xì)胞預(yù)處理，改進(jìn)融合技術(shù)，加入飼養(yǎng)層細(xì)胞促進(jìn)雜交瘤生長(zhǎng)。,致敏淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,,,離心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,,培養(yǎng)液 10ml,,,,離心 1000rpm 7min,37。C搖動(dòng)、由慢漸快1min、靜止1.5min,,加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi),5. 雜交瘤細(xì)胞及陽(yáng)性孔的篩選,細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HAT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲50多個(gè)對(duì)上述抗原有反應(yīng)的陽(yáng)性孔。,融合細(xì)胞的篩選方法,A）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等單克隆抗體（McAb）的檢測(cè)。 B）放射免疫法 （RIA）用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。 C）FACS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測(cè)。 D）間接免疫螢光法 （IFA）用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測(cè)。,6. 陽(yáng)性孔的檢測(cè),6.融合細(xì)胞的克隆,經(jīng)過(guò)抗體測(cè)定的陽(yáng)性孔，可以擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行克隆，以得到單個(gè)細(xì)胞的后代分泌單克隆抗體。 克隆化的方法很多，包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。,有限稀釋法,,,,,計(jì)數(shù),,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,7. 單克隆抗體的制取,制取方式： 體外——培養(yǎng)罐法 體內(nèi)——腹腔接種 純化： 鹽析、層析、制備型HPLC 鑒定： 特征鑒定——Ig類型、親和力、效價(jià)、特異性 決定簇鑒定——是否針對(duì)同一決定簇,（1）體外制備,體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ ml。如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。 隨著大規(guī)模的生產(chǎn)，需大量血清而使成本增加，同時(shí)血清會(huì)影響單抗的純度，大量血清的存在干擾抗體活性。1978年iscove用補(bǔ)充大豆類脂，牛血清蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白等添加成分的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞成功。,（2）體內(nèi)制備,體內(nèi)腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法。 在動(dòng)物體內(nèi)制備單抗，可在短時(shí)間獲得足夠量的單抗夠?qū)嶒?yàn)室應(yīng)用，但要消耗大量活的小鼠而不適合規(guī)模化生產(chǎn)。同時(shí)腹水中可能混有小鼠本身的抗體會(huì)給單抗的純化帶來(lái)困難。,雜交瘤細(xì)胞的凍存,當(dāng)獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后，必須將一部分雜交瘤細(xì)胞保存，否則在連續(xù)傳代的過(guò)程中，可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產(chǎn)生抗體的特性。另外在長(zhǎng)期的培養(yǎng)過(guò)程中，難免不發(fā)生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。,雜交瘤細(xì)胞通常用含有8％--10%的二甲亞砜和20％小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個(gè)月短期保存。凍存細(xì)胞需要緩慢降溫，復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。,單克隆抗體的特性,① 單一特異性，與一個(gè)抗原決定簇反應(yīng)； ② 可重復(fù)性，能夠提供完全一樣的抗體制劑； ③ 一經(jīng)制出，可無(wú)限量地供應(yīng)； ④ 生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原； ⑤ 能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。,局限性,（1）單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍。由于單克隆抗體不能進(jìn)行沉淀和凝集反應(yīng)，所以很多檢測(cè)方法不能用單克隆抗體完成。 （2）單克隆抗體的反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體。 （3）制備技術(shù)復(fù)雜，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)工，所以單克隆抗體的價(jià)格也較高,三、單克隆抗體的應(yīng)用,單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1）單克隆抗體的靶向制劑 2）單克隆抗體在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用 3）單抗藥物 制備方法： 與藥物直接連接 McAb 小分子 藥物 大分子 藥物,,,,（1）藥物與抗體直接偶聯(lián) 通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。 利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基 利用羰基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西弗氏堿，最后還原。 這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。 如：1,4-溴柔紅霉素與腫瘤細(xì)胞單抗形成的偶合物，對(duì)腫瘤有明顯的選擇毒性。,,小分子交聯(lián)劑： 同型雙功能：戊二醛、順烏頭酸酐、馬來(lái)酸酐、戊二酐。 異型雙功能：N-琥珀酰胺基-3-丙酸和寡肽等。 大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等,單抗藥物,特異性溶解血栓藥物 抗腫瘤藥物 其它藥物 利妥昔單抗是全球第一個(gè)上市的單克隆抗體藥物。,,單抗藥物面臨的問(wèn)題,單抗藥物還存在一些尚未解決的問(wèn)題，最突出的問(wèn)題是如何降低單抗的免疫原性，單抗的異源性所引起的抗體反應(yīng)，不但降低了單抗的效價(jià)，而且會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的后果。 因此，對(duì)異源性單抗進(jìn)行改造以及人源性單抗的研制成為單抗研究的重點(diǎn)。,