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目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟:目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。 一、目的基因的獲取 1.目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。 2.獲取目的基因的常用方法有以下幾種: (1)從基因文庫中獲取目的基因。 ①基因文庫:將含有某種生物不同基因的許多DNA片段導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因。 ②基因文庫種類:基因文庫包括兩種——基因組文庫,即包含了一種生物所有基因的文庫;部分基因文庫,即只包含一種生物一部分基因的文庫,如cDNA文庫。,,,,,,,,,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。 ①PCR的含義:是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 ②目的:獲取大量的目的基因。 ③原理:DNA雙鏈復(fù)制。 ④過程:第一步,加熱至90~95 ℃,DNA解鏈; 第二步,冷卻到55~60 ℃,引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上; 第三步,加熱至70~75 ℃,Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。 如此重復(fù)循環(huán)多次。 ⑤特點(diǎn):指數(shù)形式擴(kuò)增。 (3)用化學(xué)方法人工合成。 如果基因比較小,核苷酸序列又已知,也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。,,,,,,,,,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,為什么要構(gòu)建基因文庫? 提示構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一,并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知,基因又比較小,可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成。但如果所需要的目的基因的序列完全不知,或只知道目的基因序列的一段,或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因,或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同,或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同,或者想得到一種生物的全基因組序列,往往就需要構(gòu)建基因文庫。,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1.目的:使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代,同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 2.基因表達(dá)載體的組成:目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。 3.由于受體細(xì)胞不同,以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同。因此,基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別。,,,,,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來? 提示以標(biāo)記基因是四環(huán)素抗性基因?yàn)槔?過程如下:,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 1.轉(zhuǎn)化:目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。 2.常用的轉(zhuǎn)化方法 (1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞:采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。除此之外,還有基因槍法和花粉管通道法等。 (2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞:最常用的方法是顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是受精卵。 (3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞:早期的基因工程都用原核生物作為受體細(xì)胞,其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛。大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是:先用Ca2+處理細(xì)胞,使其成為感受態(tài)細(xì)胞,再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程。,,,,,,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,從細(xì)胞器的功能上分析,若通過基因工程生產(chǎn)人的糖蛋白,可以用大腸桿菌作受體細(xì)胞嗎? 提示不可以。糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細(xì)胞中,大腸桿菌是原核生物,細(xì)胞中不含有這兩種細(xì)胞器。,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定 1.首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。 2.其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,方法是采用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。 3.最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì),用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交。 4.有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否具有抗性以及抗性的程度。 蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因?qū)朊藁ㄖ仓旰笫欠褚驯磉_(dá),最簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法是什么? 提示做抗蟲實(shí)驗(yàn),觀察棉花植株是否具有抗蟲特性。,,,,,,,,,,,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,一、獲取目的基因與基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1.cDNA文庫與基因組文庫的主要區(qū)別,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,2.幾種獲取目的基因的方法的比較,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,(2)構(gòu)建方法(以質(zhì)粒為例):,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,【例1】 天然的玫瑰沒有藍(lán)色花,這是由于缺少控制藍(lán)色色素合成的基因B,而開藍(lán)色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B?，F(xiàn)用基因工程技術(shù)培育藍(lán)玫瑰,下列操作正確的是( ) A.提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的DNA,再擴(kuò)增基因B B.利用限制酶從開藍(lán)色花的矮牽牛的基因文庫中獲取基因B C.利用DNA聚合酶將基因B與質(zhì)粒連接后導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞 D.將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌,然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,解析由題意知:控制藍(lán)色色素合成的基因B是目的基因,提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的DNA,再擴(kuò)增基因B,然后導(dǎo)入天然的玫瑰細(xì)胞中,經(jīng)培育該受體細(xì)胞即能獲得藍(lán)玫瑰,A項(xiàng)正確。限制酶是將某DNA分子上的目的基因切割下來,而不是獲取目的基因,B項(xiàng)錯(cuò)誤。將目的基因B與質(zhì)粒連接需用DNA連接酶,而不是DNA聚合酶,C項(xiàng)錯(cuò)誤。基因B需與質(zhì)粒連接形成基因表達(dá)載體再導(dǎo)入農(nóng)桿菌,然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞,而不能將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌,D項(xiàng)錯(cuò)誤。 答案A,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,下列對(duì)構(gòu)建基因表達(dá)載體的敘述,不正確的是 ( ) A.需要限制酶和DNA連接酶參與 B.基因表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子和終止密碼子 C.通常用抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因 D.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心 解析基因表達(dá)載體的構(gòu)建關(guān)系到目的基因在受體細(xì)胞中能否表達(dá),它是基因工程的核心,它的構(gòu)建需要限制酶和DNA連接酶參與,它的結(jié)構(gòu)應(yīng)由啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因等組成。終止密碼子是指位于mRNA上的不編碼氨基酸的三個(gè)相鄰堿基,是翻譯結(jié)束的位點(diǎn),而終止子位于基因的尾端,是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段,它是轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點(diǎn)。 答案B,,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,二、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及檢測(cè)與鑒定 1.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的常用方法,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,2.目的基因的檢測(cè)與鑒定的方法比較,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,【例2】 閱讀如下資料,并回答下列問題。 科學(xué)家將牛生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫阎?得到了體型巨大的“超級(jí)小鼠”?？茖W(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出轉(zhuǎn)基因煙草。 (1)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠的受精卵中常用 法。 (2)構(gòu)建基因表達(dá)載體常用的工具酶是 和 。 (3)在培育有些轉(zhuǎn)基因植物時(shí),常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,農(nóng)桿菌的作用是 。,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,解析(1)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物受精卵常用的方法是顯微注射法。(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體常用的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(3)在培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,因?yàn)檗r(nóng)桿菌能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物。 答案(1)顯微注射 (2)限制性核酸內(nèi)切酶 DNA連接酶 (3)感染植物,將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,利用外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá),可生產(chǎn)人類所需的產(chǎn)品。下列選項(xiàng)中能說明目的基因完成表達(dá)的是( ) A.棉花細(xì)胞中檢測(cè)到載體上的標(biāo)記基因 B.山羊乳腺細(xì)胞中檢測(cè)到人生長(zhǎng)激素的基因 C.大腸桿菌中檢測(cè)到人胰島素基因的mRNA D.酵母菌細(xì)胞中提取到人的干擾素 解析基因的表達(dá)即基因控制蛋白質(zhì)的合成,包括轉(zhuǎn)錄和翻譯,僅僅轉(zhuǎn)錄出mRNA還不能叫表達(dá),只有合成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)才能證明目的基因完成了在受體細(xì)胞中的表達(dá)。 答案D,,,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分析,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,(1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建,需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。 (2)基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是用Ca2+處理。 (3)目的基因能夠在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的關(guān)鍵是目的基因插入受體細(xì)胞染色體DNA上。 (4)由受體細(xì)胞形成植株通常需要用到植物組織培養(yǎng)技術(shù)。,一,二,知識(shí)精要,典題例解,遷移應(yīng)用,基因工程的基本操作程序,1.混淆:啟動(dòng)子與終止子、起始密碼子與終止密碼子的區(qū)別 (1)啟動(dòng)子和終止子都在DNA上,在遺傳信息轉(zhuǎn)錄時(shí)起作用。啟動(dòng)子是啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的開始,終止子是DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄停止的一段DNA序列,其組成單位都是脫氧核苷酸。 (2)起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上三個(gè)相鄰堿基。起始密碼子決定翻譯的開始,終止密碼子決定翻譯的停止。,【例1】 據(jù)圖分析,下列有關(guān)基因工程的敘述,錯(cuò)誤的是( ) A.用限制酶Ⅰ和酶Ⅱ同時(shí)切割目的基因和質(zhì)?？煞乐苟呷我饨Y(jié)合 B.重組質(zhì)粒中包含啟動(dòng)子和終止子 C.與啟動(dòng)子結(jié)合的應(yīng)該是DNA聚合酶 D.標(biāo)記基因的作用是便于目的基因的檢測(cè),解析限制酶Ⅰ和酶Ⅱ識(shí)別的核苷酸序列不同,所以用限制酶Ⅰ和酶Ⅱ同時(shí)切割目的基因和質(zhì)?？煞乐苟呷我饨Y(jié)合,A項(xiàng)正確;基因表達(dá)載體主要由啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因和目的基因組成,B項(xiàng)正確;啟動(dòng)子和終止子都是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段,其中啟動(dòng)子是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn),能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程,而終止子能終止轉(zhuǎn)錄過程,C項(xiàng)錯(cuò)誤;重組DNA分子上的標(biāo)記基因可用于目的基因的檢測(cè)與鑒定,D項(xiàng)正確。 答案C,,2.混淆:不同分子檢測(cè)的原理、場(chǎng)所、探針的異同 (1)原理:進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)原理與復(fù)制水平的檢測(cè)原理是相似的,只是被檢測(cè)的物質(zhì)不再是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA,而是轉(zhuǎn)基因生物的細(xì)胞內(nèi)的mRNA;進(jìn)行翻譯水平的檢測(cè),則是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。 (2)場(chǎng)所:不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測(cè),都是在體外進(jìn)行的。 (3)探針:在DNA分子、mRNA分子上檢測(cè)目的基因是否插入、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時(shí),用的探針都是放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。,【例2】 (2016全國(guó)丙,40)圖(a)中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn),圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點(diǎn)是唯一的)。 圖(a) 圖(b),根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí),回答下列問題。 (1)經(jīng)BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被 酶切后的產(chǎn)物連接,理由是 。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子,如圖(c)所示。這三種重組子中,不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有 ,不能表達(dá)的原因是 。,圖(c),(3)DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來的酶,常見的有 和 ,其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是 。,解析本題考查限制酶的特點(diǎn)及基因表達(dá)載體的構(gòu)建。 (1)由題圖(a)可知,限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同,所以經(jīng)BamHⅠ酶切割后得到的目的基因可以與題圖(b)所示表達(dá)載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。 (2)在基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子應(yīng)位于目的基因的首端,終止子應(yīng)位于目的基因的尾端,這樣目的基因才能表達(dá)。圖中甲、丙均不符合,所以不能表達(dá)目的基因的產(chǎn)物。 (3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4 DNA連接酶,其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是T4 DNA連接酶,但其對(duì)平末端的連接效率較低。,答案(1)Sau3AⅠ 兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游,丙中目的基因插入在終止子的下游,二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(其他合理答案也可) (3)Ecoli DNA連接酶 T4 DNA連接酶 T4 DNA連接酶(其他合理答案也可),