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2019-2020年高中生物第一部分微生物的利用1.1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離2素材浙科版 一、培養(yǎng)基的配置： 我們用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)大腸桿菌。 配置1000ml的培養(yǎng)基（可由教師在實(shí)驗(yàn)前配置好，也可由學(xué)生分小組后在實(shí)驗(yàn)課上操作）。 1、配方： 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g Nacl 5g 瓊脂 20g 2、稱(chēng)量：準(zhǔn)確稱(chēng)取各成分。 3、溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到1000mL。整個(gè)過(guò)程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。 4、調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0——7.2。 5、滅菌：將配置好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加上棉塞，包上牛皮紙，用皮筋勒緊，集中放入高壓滅菌鍋內(nèi)，121攝氏度、100千帕壓力下滅菌15min。5——8套培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包作一包，于干熱滅菌鍋內(nèi)160——170℃條件下滅菌2小時(shí)。 6、倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。 其過(guò)程是：①將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰；③用左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過(guò)來(lái)放置。 倒過(guò)來(lái)放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過(guò)程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移已滅菌的培養(yǎng)基時(shí)，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會(huì)在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。 二、大腸桿菌的接種、培養(yǎng)： 1、接種常用的方法有平板劃線(xiàn)法和稀釋涂布平板法。 （1）平板劃線(xiàn)法： ①操作步驟：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi)。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線(xiàn) 3～5條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線(xiàn)部分作第2次平行劃線(xiàn)，然后再用同樣方法，通過(guò)第二次平行劃線(xiàn)部分作第三次平行劃線(xiàn)和通過(guò)第三次平行劃線(xiàn)部分作第四次平行劃線(xiàn)。劃線(xiàn)時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線(xiàn)完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。 ②該方法原理及其注意事項(xiàng)： 用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線(xiàn)，在劃線(xiàn)過(guò)程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少。劃線(xiàn)到最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在培養(yǎng)10～20h后，可由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會(huì)重疊。如果再將每個(gè)菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線(xiàn)，則每個(gè)斜面的菌群就是由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。 取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線(xiàn)外，其余劃線(xiàn)前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線(xiàn)前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者。 （2）稀釋涂布平板法： 先將培養(yǎng)的菌液稀釋?zhuān)ǔＯ♂尩?0－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開(kāi)的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿有20個(gè)以?xún)?nèi)的單菌落最為適合。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。 2、培養(yǎng)： 將接種后和未接種的培養(yǎng)基都放入37℃恒溫箱中，培養(yǎng)12小時(shí)和24小時(shí)后，分別觀(guān)察記錄結(jié)果。 三、實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)相關(guān)問(wèn)題： 1、未接種的培養(yǎng)基是否有菌落？如果有，為什么？ 2、接種了大腸桿菌的培養(yǎng)基上是否有菌落？其顏色、形狀、大小是否相同？ 3、如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了不同的菌落，請(qǐng)分析可能的原因。 四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)： ① 實(shí)驗(yàn)中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時(shí)的水分； ② 物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開(kāi)排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，加熱結(jié)束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務(wù)必降至零時(shí)打開(kāi)鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸； ③ 在用任何器皿轉(zhuǎn)接時(shí)，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺(tái)面上，接種時(shí)要在酒精燈火焰旁操作； ④ 培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染； ⑤ 接種時(shí)要膽大心細(xì)，動(dòng)作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵； ⑥ 接種后，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，水流擴(kuò)散會(huì)使菌落擴(kuò)散，就很難形成單菌落