乙肝病毒講解CIL病毒分離技術.ppt
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CIL病毒分離技術_乙肝病毒,北京京科肝泰醫(yī)院,病毒性肝炎在我國各類傳染病中發(fā)病率最高 ?HBV攜帶者最終死于相關肝病的危險性,男性為50%,女性為15%,與男性病人的病毒不易被清除及吸煙、飲酒等相關 ?中國的慢性乙肝病人中25%~40%最終死于肝硬化或合并肝癌;,乙肝是一類大病,在我國感染人數(shù)有1到2億,目前國內或者國外對于乙肝的治療主要方法還是抗病毒保肝護肝的治療。然而,患者的病情往往會反反復復,即使對于患者的病情控制的非常得當,也只能在一段時間內起到較好的效果。如何能夠徹底的治愈,現(xiàn)在還沒有很好的方案。,肝癌30-50萬 ?肝硬化500萬 ?慢性重型肝炎50-100萬 ?慢性遷延性肝炎階段1000萬 ?HBV攜帶者一億九千萬,傳染源:主要為急、慢性乙肝患者或病毒攜帶者 傳播途徑:是通過血液傳播,大多數(shù)情況通過注射;二是通過母嬰傳播;其次性傳播。垂直傳播是我國HBV感染的主要模式.,流行病學特征,2003年的一項調查表明隨著社會發(fā)展、醫(yī)療技術條件的改進、人民生活方式的變遷,通過生活密切接觸傳播已越來越成為乙肝的主要傳播方式 乙肝不會通過水和食物以及通常的接觸傳播的(不過不能合用剪刀,指甲鉗,牙刷等),,,乙肝病毒的傳播,7,感染者年齡高峰:低發(fā)病區(qū):20~40歲 高發(fā)病區(qū):4~8歲 男女感染率相近,但發(fā)病者男多于女 感染時年齡越小,越易形成慢性肝炎、肝硬化或慢性HBV攜帶狀態(tài)(免疫耐受) 感染后對相同HBsAg亞型的HBV再感染有持久免疫力,但對不同亞型的保護力不完全,易感人群,潛伏期:2~6個月 臨床類型:嬰幼兒期感染近90%轉為慢性,成年人感染85%以上可痊愈,10%左右轉為慢性 痊愈 痊愈 靜止性肝硬化,乙肝臨床特點,,急性感染,慢性乙型肝炎,肝硬化,肝癌,死亡,,,,慢性攜帶者,肝硬化,死亡,三部曲:肝硬化、慢性乙肝、肝癌,乙肝預后,慢性乙肝,肝硬化,肝癌,,,10%,10%,?乙肝五項:HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb ?HBV-DNA:血液中最先能被檢驗出來(感染一周內),但其檢測比較昂貴,乙肝檢測,HBV-DNA(+)是病毒感染的直接證據(jù) (-)提示病毒復制水平低或已清除,接種疫苗是最好的方法,13,乙肝預防,安全注射(包括針具),對牙科器械、內鏡等醫(yī)療器具應嚴格消毒,嚴格防止醫(yī)源性傳播 ?服務行業(yè)中的理發(fā)、刮臉、修腳、穿刺和文身等用具也應嚴格消毒 ?注意個人衛(wèi)生,不共用剃須刀和牙具等用品。進行正確的性教育,若性伴侶HBsAg陽性者應接種乙型肝炎疫苗 ?對HBsAg陽性的孕婦,應避免羊膜腔穿刺,并縮短分娩時間,保證胎盤的完整性,盡量減少新生兒暴露于母血的機會,傳播途徑預防,診斷急性或慢性乙型肝炎患者時,應按照中華人民共和國傳染病防治法,及時向當?shù)丶膊☆A防控制中心(CDC)報告,并應注明是急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎 ?建議對患者的家庭成員及其他密切接觸者進行血清HBsAg、抗-HBc和抗-HBs檢測,并對其中的易感者(該3種標志物均陰性者)接種乙型肝炎疫苗,對患者和攜帶者的管理,根據(jù)病情確定是否住院或在家治療 患者用過的醫(yī)療器械及用具(如采血針、針灸針、手術器械、劃痕針、探針、各種內鏡及口腔科鉆頭等)應嚴格消毒 尤其應加強對帶血污染物的消毒處理,乙肝患者的處理,,不能獻血及從事國家法律規(guī)定的特殊職業(yè)(如服兵役等) 可照常生活、學習和工作,要加強隨訪 傳染性高低,主要取決于血液中HBV-DNA水平,與血清ALT、AST或膽紅素水平無關,慢性HBV攜帶者及HBsAg攜帶者的處理,乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒,也稱丹氏顆粒,顆粒分為外殼和核心兩部分。它是一種DNA病毒,屬于嗜肝DNA病毒科,這是一種傳染性很強的病毒,它可以通過血液、精液和其他體液進行傳播。乙型肝炎病毒治療主要以適當休息和合理營養(yǎng)為主,加上抗病毒藥物治療。,HBV病毒介紹,以肝臟為主要靶器官,對肝臟有親嗜性,引起肝臟炎癥的病毒。,感染乙肝病毒的病人血清中有三種不同形態(tài)的顆粒,分別為大球形顆粒(直徑42nm)、小球形顆粒(直徑22nm)和管形顆粒(直徑22nm)。,大球形顆粒又稱Dane顆粒,是1970年Dane首先用電鏡在乙肝病人血清中發(fā)現(xiàn)的。Dane顆粒是有感染性的完整HBV顆粒,呈球形,具有雙層衣殼。外衣殼由來自宿主的脂質雙層和包膜蛋白組成,有大約400個HBV表面抗原(HBsAg)即蛋白鑲嵌于脂質雙層中。用離子去垢劑處理病毒顆粒,去除病毒外衣殼后,暴露出內層核心。核心的表面為病毒的內衣殼,內衣殼蛋白為HBV核心抗原(HBcAg)。HBcAg經(jīng)酶或去垢劑作用后可暴露出e抗原(HBeAg)。核心顆粒中間包裹著雙鏈DNA分子、DNA聚合酶(P蛋白)等。,而小球形顆粒和由小球形顆粒串聯(lián)而成的管形顆粒均由病毒的包膜蛋白構成,不含病毒基因組,因而不具有感染性,被稱為亞病毒顆粒。,HBV 感染與復制過程 感染途徑 乙型肝炎病毒無論通過哪個途徑,乙肝病毒進入血液循環(huán)在體內流動,會經(jīng)過人體的一個非特異性免疫清除,在血液循環(huán)里面要經(jīng)過吞噬細胞的吞噬。病毒在循環(huán)中突破了這些屏障,游離到它需要復制的靶位,即肝細胞。病毒進入肝細胞復制,首先要使肝細胞接受它,也就是說肝細胞上要有受體與病毒結合。病毒可以依靠肝細胞的細胞膜的某一部分,通過胞引作用進到肝細胞內。病毒可以在此釋放核酸,核酸在肝細胞內依靠細胞內的原料進行復制和合成。,復制與免疫應答 病毒一旦在肝細胞內復制,肝細胞就會有核酸出現(xiàn),核酸產(chǎn)生后核心抗原就會相應的出現(xiàn)。核心抗原會包裹核酸,但由于核酸分子較小,包裹以后會有多余的一部分結構。多余的部分可以被核內的一些酶切掉,這一部分就是 E 抗原。因此 E 抗原的存在就是乙肝病毒復制的一個標志。 E 抗原從肝細胞釋放到細胞以外,血液循環(huán)里面就能夠檢測到 E 抗原的存在。人體的免疫細胞就會通過免疫的應答產(chǎn)生相應的抗體,即 E 抗體。在病毒復制的初期, E 抗原產(chǎn)生的量要大于抗體,因此這時檢測到的是 E 抗原而 E 抗體檢測不到。,免疫損傷 人體除在血液循環(huán)內對抗原進行應答之外,含有病毒復制的肝細胞還會有細胞膜結構的一些變化。這些變化可以誘導人體的免疫細胞,對有病毒的肝細胞進行免疫應答,從而對該細胞進行殺傷,使肝細胞發(fā)生免疫損傷,細胞內的轉氨酶就會釋放到血液循環(huán)內,細胞核也會破碎從而把細胞內的物質釋放出來,這就是免疫應答的過程,導致了免疫損傷。因此也導致了我們所說的肝功能損害,通過一些生化指標的監(jiān)測可以監(jiān)測到肝功的損害。,cccDNA 的形成 乙肝是慢性疾病,乙肝病毒在肝細胞內是連續(xù)傳代。病毒一旦進入肝細胞以后就會開始復制,復制出的病毒就會從肝細胞里面釋放出來,而釋放出來的病毒除了被人體免疫系統(tǒng)進行識別和殺傷之外,還有一部分會再侵犯其他的肝細胞,并在其他肝細胞里面再進行這樣的復制,如此循環(huán)。能夠在肝細胞里復制的病毒是有活性的,這種乙肝病毒它的 DNA 是松散的雙鏈結構。它是個這種雙鏈結構是松散的而不是閉合的環(huán)結構。但是,有些病毒的核酸在進到肝細胞的細胞核以后,在 DNA 聚合酶的作用下,將環(huán)形松散的缺口補齊,變成一個超螺旋的共價、閉合、環(huán)狀 DNA ,即 cccDNA 。,HBV cccDNA:“睡眠”的病毒 DNA cccDNA 形成之后狀態(tài)比較穩(wěn)定,可以稱其為肝細胞核內“睡眠”的病毒 DNA ,當病毒活躍性復制時,它又可以作為一個模塊來復制病毒。一般在每個肝細胞核內,可以有 5~50 拷貝的 cccDNA 。,cccDNA 的意義 cccDNA在肝細胞內很穩(wěn)定,只要肝細胞不被破壞很少釋放到外周血液循環(huán),因此很難從血液中檢測。但如有大片肝細胞壞死,大量的 cccDNA 就會從細胞核內釋放到血液循環(huán),此時人體的免疫系統(tǒng)除對釋放的 cccDNA 有應答外,對于人的細胞核也會產(chǎn)生抗體,即抗核抗體??购丝贵w的存在是細胞核暴露所引起的。,是乙肝病毒的核心物質和病毒復制的基礎。在病毒DNA攜帶的遺傳基因發(fā)出的“指示”下,HBVDNA分別復制出新的病毒外殼和DNA核心,隨后重新組裝,形成大量的新病毒,釋放出來繼續(xù)感染其他肝細胞。 乙肝病毒DNA是HBV感染最直接、特異性強和靈敏性高的指標,HBV-DNA陽性,提示HBV復制和有傳染性。HBV-DNA越高表示病毒復制越厲害,傳染性強。中國以及亞太地區(qū)乙肝治療專家均指出:乙肝病毒的持續(xù)復制是乙肝致病的根本原因,乙肝治療的根本目的是抑制病毒復制。,乙肝病毒DNA(HBV-DNA),病毒的繁殖被稱之為“復制”,在復制的過程中,有兩個很重要的因素:一個是催化劑,另一個是模板。沒有這兩個因素,乙肝病毒就不能復制。乙肝病毒復制的“催化劑”就是乙肝病毒DNA(即HBV-DNA)聚合酶。沒有這種聚合酶的作用,乙肝病毒的復制就會停止。,檢測乙肝病毒DNA是判斷乙肝病毒有無復制的“金指標”,它主要是用來判斷人體內存在乙肝病毒的多少和傳染程度的。如果檢測值大于1000或者5.0e+ 002拷貝/ML。說明乙肝病毒DNA呈陽性,提示HBV復制和有傳染性。HBV-DNA越高表示病毒復制越厲害,傳染性強。這對于乙肝治療過程中的監(jiān)測,治療效果的判斷,治療方案的制定都有著重要的意義。,乙肝病毒的基因組(HBV-DNA)是由兩條螺旋的DNA鏈圍成的一個環(huán)形結構。其中一條較長負鏈已經(jīng)形成完整的環(huán)狀;另一條長度較短的正鏈,呈半環(huán)狀。在感染肝細胞之后,這條半環(huán)狀的DNA鏈就會以負鏈為模板,在催化劑──HBV-DNA聚合酶的作用下延長,最終形成完整的環(huán)狀。這時的乙肝病毒基因組就形成了一個完全環(huán)狀的雙股DNA。把這種DNA稱做共價閉合環(huán)狀DNA(即cccDNA),可以把它看作是病毒復制的原始模板。模板形成后,病毒基因會以其中的一條cccDNA為模板,利用肝細胞基因中的酶和DNA聚合酶的“催化”,一段基因又一段基因地復制,形成負鏈和正鏈。最后再裝配到一起形成新的HBV-DNA顆粒。,復制的第一步:黏附 HBV人侵人體后,依靠其外膜(表面抗原,HBsAg)能粘附在肝細胞膜上,當然,粘附的首要條件是HBsAg先要識別肝細胞膜。一旦粘附成功,HBv的外膜也就完成了它的使命,甩掉了外膜,HBV鉆進肝細胞內。,復制的第二步:脫殼 HBV核心部分來到肝細胞內,在肝細胞漿中還要脫掉它的“核殼”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG),這樣,就暴露出了它最核心部分,即乙肝病毒核酸(HBvDNA),HBV大有“赤膊上陣”之意。HBVDNA包涵著乙肝病毒的全部基因,是它主宰著HBv的復制的。,復制的第三步:入核 HBvDNA從肝細胞漿內進入肝細胞核,在這里它要進一步發(fā)育完善,形成了HBv的“共價閉合環(huán)狀脫氧核塘核酸”(HBvcccDNA)。這個cccDNA十分了得,它深深藏匿在肝細胞核內,而肝細胞核外面有一層堅韌的核膜。目前藥物都難以通過這堅韌的核膜,因而對cccDNA也無可奈何,但cccDNA卻掌控著HBv所有的遺傳信息,指令著HBv的復制。因此.現(xiàn)有的藥物想徹底消滅人體內的HBv真比登天還難,這些藥物只能抑制HBv的繁殖或復制,“全部轉陰”也只能是一種幻想。,復制的第四步:轉錄 HBV在這一階段會以cccDNA為“模子”,像錄音帶似的把HBvcccDNA上的所有信息全都轉錄到“信息核糖核酸”(mRNA)上。這個轉錄過程需要人體內的酶類幫忙,因為所有的病毒都不能自己獨立生活.必須有生物的機體幫忙,才能完成這個轉錄過程。HBv也是這樣。在人體酶類的幫助下完成它的復制環(huán)節(jié)。,復制的第五步:翻譯 在mRNA上已錄取了HBv的所有信息,然后就是“翻譯”了,其實就是開始制造病毒蛋白。MRNA通過“翻譯”過程,可將HBv的各種蛋白制造出來,如HBv的外膜蛋白(HBsAg)、核殼蛋白(HBeAg、HBcAg)、HBvDNA多聚酶等;至此,HBv的外膜有了,HBv的核殼也有了,這些東西只是零件,飄浮游離著的,還有重要的HBv最核心部分沒有“制造”山來。,復制的第六步:逆轉錄 “逆轉錄”:把HBv的遺傳信息從DNA轉錄到RNA上叫做“轉錄”,是正常的“順轉錄”;而將HBv的遺傳信息從RNA上再轉錄到DNA上,就叫做“逆轉錄”了。那么,HBv的mRNA上的遺傳信息最后就轉錄成了HBV的DNA,這時,HBv的最核心部分(即HBvDNA)也算制造完成。,復制的第七步:組裝 從第五步和第六步的復制看來,HBv的所有零件均已制作完畢,到了第七步也就簡單了,把這些零件進行組裝,裝配妥了,HBv的復制也算大功告成了。 HBv就是這樣繁殖或復制的??雌饋砗孟裢碗s,其實HBv復制過程是很快的.一個復制周期不到48小時。復制出的下一代HBv或侵入另外的健康的肝細胞,或被釋放到血液中去,在人們抽血化驗時也就被檢測到了。,乙肝DNA檢測數(shù)量多一般代表病情發(fā)展迅速、傳染性強,此時需要積極的抗病毒治療。由于HBV-DNA是乙肝病毒數(shù)量最靈敏的指標,是乙肝治療是判斷身體內乙肝病毒數(shù)目的一個重要而且關注的指標。所以當出現(xiàn)乙肝DNA檢測數(shù)量多的情況,采用快速有效殺滅乙肝病毒的療法,可以最大化的實現(xiàn)病情發(fā)展減緩,最短時間內改善患者癥狀,從而實現(xiàn)乙肝的快速治愈。,陰性 醫(yī)生在衡量患者病情時,需要檢測血液中是否含有乙肝病毒DNA,看乙肝病毒DNA陰性還是陽性,確定是否有感染性;而且還要檢測一下乙肝病毒的數(shù)量,就是判定感染性的高低。 乙肝病毒DNA正常值是500cop/ml,如果乙肝病毒DNA檢查結果低于500cop/ml,就結論為乙肝病毒DNA陰性,化驗單上寫陰性,或“500cop/ml”。,乙肝病毒DNA陰性,說明血液里的乙肝病毒含量較低,體內病毒不活躍,處于低復制或不復制的狀態(tài)。,陽性 乙肝HBVDNA是乙肝病毒復制的指標,乙肝病毒HBV-DNA陽性提示有病毒復制。HBVDNA的含量高低,提示病毒復制是否活躍。實驗室檢測下限是500/ml。此項指標與乙肝五項,肝功能,肝膽脾B超,血常規(guī)等,作為乙肝患者和乙肝病毒攜帶者病情的主要參考指標,對于確定治療計劃以及評價療效,尤其是抗病毒治療,有重要意義。,乙肝病毒是一種部分雙鏈DNA(核酸)病毒,也就是說它的遺傳物質是DNA,它載有病毒所有遺傳信息,研究證明,乙肝病毒的裸DNA(沒有蛋白質包裹DNA)就有感染性,完成對宿主的侵襲,造成宿主體內出現(xiàn)完整的乙肝病毒顆粒。也就是說乙肝病毒DNA相當于完整的乙肝病毒顆粒。,因此,如果體內檢測到乙肝病毒DNA,不管別的乙肝標志物如何(陽性或陰性),此人就可以確定為乙肝病毒感染者,其血液及體液具有較強的傳染性。若轉氨酶再升高就是乙肝患者,需要保肝、降酶、抗病毒治療。其親屬最好注射乙肝疫苗以產(chǎn)生保護性抗體以免被傳染。,46,發(fā)病機制,針對 cccDNA 的治療現(xiàn)狀 目前臨床治療時雖然很多抗病毒藥物,但并沒有能夠進到細胞核以內的藥物,還不能夠達到清除細胞核內 cccDNA 的目的。現(xiàn)有的抗病毒治療只是抑制病毒的復制,而不能把藏匿于核內的,復制的最基本模板—— cccDNA 去掉。因此肝病往往是慢性的,而且比較容易復發(fā),所謂復發(fā),就是在肝細胞核內“睡眠”的病毒 DNA 按照病毒自身的復制周期進行復制。 對于肝細胞以外的器官是否有 cccDNA 的存在,目前還在研究階段。另外,目前還沒有一個比較穩(wěn)定、可靠和敏感的 cccDNA 檢測的方法上市,因此 cccDNA 的檢測和治療都是相當困難的。,cccDNA 和 rcDNA 的差異 (一)一級結構差異 從核酸的一級結構來看 cccDNA 是一條完整的雙鏈,是共價閉和環(huán)。松弛環(huán)狀 DNA( rcDNA ),雖然也是環(huán)狀的,但是它是有缺口的,它不完整的。 (二)空間結構差異 從核酸空間結構來看cccDNA 是超螺旋結構;rcDNA 是松弛環(huán)狀,不是超螺旋的結構。,檢測血清或血漿 HBV DNA 陽性有什么臨床意義? 1. 判斷血清中是否有 HBV DNA 的存在 我們檢測到的 HBV DNA 包括 完整 HBV 病毒和 DNA 片段。 目前我們用的 HBV DNA 熒光 PCR 法,還不能區(qū)分是完整病毒還是片段。只要檢測到的病毒載量在檢測線以上就可以定為標本含有 HBV DNA 。,2. 判斷抗病毒療效的評估指標 細胞內 HBV DNA 和 HBV DNA 確認方法。 病人采用各種抗病毒藥物,比如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋或替米夫定等抗病毒藥物,因為這些藥可以有效的抑制病毒復制,用藥之前或用藥之后,病人的血清里或外周血白細胞里是不是還有病毒的存在?病毒下降了多少?是不是有病毒的反彈?,這是臨床醫(yī)生關心的問題。隨著抗病毒藥物用藥時間的延長,有些病人血清里面的 HBV DNA 一直處于檢測線以下。因此目前臨床醫(yī)生有一些新的需求,就是能不能確認病人血清里究竟有沒有 HBV DNA 。不同的實驗室報告檢測低限值不一樣,有的實驗室報 1000 IU ,有的實驗室報 100 IU , COBAS TaqMan12 個, 12 個還是有病毒,血清里究竟有多少個?是臨床急需的一種 HBV DNA 確認方法。即確認血清里面究竟有沒有病毒。。,3.HBV DNA 陽性與傳染性 感染乙肝病毒 必須達到一定的量,突破各種屏障( 血液里的補體、細胞因子、抗體等 ),進入肝細胞復制, 才能達到傳染性的要求,因此并不是接觸到病毒都會被感染,4, HBV DNA 定量與乙肝血清學模式不同組合的意義。如:大三陽( 表面抗原、 E 抗原和核心抗體陽性 )并抗 HBs 陽性: HBsAg/IgM 。 E 抗原陽性說明病人體內的乙肝病毒處于一種活躍性的復制狀態(tài)。這時有的病人合并表面抗體的陽性,是不是獲得一定的抵抗力?不是。表面抗體往往是病毒復制時誘發(fā)了機體免疫答應而產(chǎn)生相應的抗體,這個抗體是針對表面抗原的 IgM 大蛋白抗體。因此它是機體對乙肝病毒復制免疫反抗的結果。這時要提高病人或保持病人的免疫功能 ;小三陽并抗 HBs 陽性:病毒復制、不同型病毒的感染等 ; 抗 HBs 或抗 HBc 與 HBV DNA 同時陽性:細胞內 HBV 的釋放。,血清 cccDNA 與肝臟組織內 cccDNA 的不同意義 最早的觀點認為 cccDNA 是雙價閉環(huán)環(huán)狀 DNA ,它只在肝細胞里存在。后來越來越多的研究者發(fā)現(xiàn),血清里不但有 cccDNA ,而且也有肝組織內的 cccDNA 。因為血清里的 cccDNA 是從壞死的肝細胞釋放出來的,并且它是環(huán)狀的,不易被蛋白結合,也不易被消化,因此與肝組織內的 HBV DNA 有著不同的意義。,目前認為血清里的 cccDNA 存在是病毒啟動復制的標志,即病毒正處在復制的上升期,而肝組織內的 cccDNA 是病毒慢性化的標志。如果判斷抗病毒藥物效果,檢測血清里的 cccDNA 沒有太多的意義,而肝組織內的 cccDNA 反而有意義。即如果外周血 HBV DNA 已經(jīng)轉移到檢測線以下,判斷病毒是不是徹底清除?我們要檢測肝組織內的 cccDNA 。,生物暴露與措施 1. 無損傷暴露 部位的清洗方法不同, 如果血清濺到衣服上,通過有效的消毒液進行浸泡、清洗,一般浸泡的時間不能低于半個小時;如果濺到皮膚上,直接用洗滌液來洗,不要用力搓,要輕搓,然后用流水沖掉;如果濺到眼睛上,最忌諱的是用力來揉搓眼睛,用清水沖洗,一般病毒很難通過皮膚黏膜。也要對濺到你眼睛的血漿里做一個鑒定,看看它是不是含有病毒,病毒含量高低 。,,2. 創(chuàng)傷暴露 確定污染源 HBV 含量狀態(tài), 如果高于 104 以上,感染的可能性很大,如果低于 104 以下,感染的可能性非常小。要在最短時間內要注射有效的高效價免疫球蛋白。,3. 特殊人群的討論 孕婦和兒童。 如果孕婦在懷孕以前是乙肝,盡可能建議孕婦通過干擾素或核苷類似物把體內的病毒降到檢測線以下,停藥 3 個月再懷孕。有的孕婦懷孕 7 、 8 個月發(fā)現(xiàn)自己感染了乙肝,這時不主張終止妊娠,應該保持自身良好的免疫狀態(tài)和良好的精神狀態(tài),在孩子出生以后要第一時間使孩子和母親的血液脫離,同時對孩子注射高效價免疫球蛋白??梢詫δ氀M行檢測,臍血里 HBV DNA 是陰性,孩子就沒被感染。,- 配套講稿:
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