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2019-2020年高中生物 實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離輔導教案 浙科版 導學誘思 一、大腸桿菌 1．大腸桿菌屬于革蘭氏________性菌，為________型的腸道桿菌。 2．結構：屬于________生物。 3．用途：是在________技術中被廣泛采用的工具。 4．與人類的關系：它生活在人類的________中，一般對人________(“有”還是“無”)害。有一些菌株對人體能產(chǎn)生危害，因為它們可以侵蝕________并產(chǎn)生________。任何大腸桿菌如果進入人的________系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。 答案：1.陰　兼性厭氧 2．原核 3．基因工程 4．腸道　無　腸黏膜　毒素　泌尿 二、細菌的培養(yǎng)和分離 1．細菌的培養(yǎng)： (1)細菌的繁殖：細菌以________的方式繁殖，分裂速度很快，約________分裂一次。 (2)培養(yǎng)細菌的方法：培養(yǎng)細菌，需要將________________________________________________________________________ 轉移到________中，一般用________來轉移帶菌的培養(yǎng)物。 (3)用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌的差別： 接種后，培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基類型 接種方法 接種后培養(yǎng)的時間(單位：小時) 培養(yǎng)結果 液體培養(yǎng)基 接種環(huán)直接接種 培養(yǎng)8 h后 每毫升培養(yǎng)基中有________個細菌 固體培養(yǎng)基 用接種環(huán)在培養(yǎng)基上用________________________________________________________________________的方式接種(該法還可以用于______) 培養(yǎng)10～20 h后 一個細菌細胞會繁殖成許多個細菌細胞，這些細胞________________________________________________________________________________，形成____________________________________________________________ 2.細菌的分離： (1)分離的方法與特點：分離細菌有________和________2種。前者方法簡單，后者操作復雜，但是______________________________________________________________更易分開。 (2)本實驗進行大腸桿菌分離，是用________法，就是在________培養(yǎng)基上進行細菌的________。 答案：1.(1)分裂　20 min　(2)已有細菌的培養(yǎng)物　新的培養(yǎng)基　接種環(huán)　(3)幾億　劃線　分離細菌　緊緊聚集在一起 菌落 2.(1)劃線分離法　涂布分離法　單菌落　(2)劃線分離 固體平面　劃線培養(yǎng) 三、滅菌操作 1．滅菌操作的原因：為了獲得________的培養(yǎng)物，其關鍵是防止外來________的入侵污染。因此，在培養(yǎng)微生物時必須進行________操作。 2．無菌操作的條件： (1)首要條件是________必須是無菌的； (2)________必須是無菌的； (3)________的過程必須是無菌的等。 答案：1.純凈　雜菌　無菌 2．(1)各種器皿　(2)各種培養(yǎng)基　(3)菌轉移操作 四、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗 1．實驗目的： (1)進行大腸桿菌的________，利用________培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作； (2)進行大腸桿菌的________，用________培養(yǎng)基進行細菌的________培養(yǎng)； (3)說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理。 2．實驗步驟 (1)滅菌：用________在________壓力下對LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行滅菌________min。 (2)自________向________中轉移并分裝固體培養(yǎng)基： 待冷卻至______左右，將三角錐形瓶中的______培養(yǎng)基，在______上分裝至幾個______中，制成______培養(yǎng)基。 (3)將大腸桿菌自________轉移到________中的________培養(yǎng)基中培養(yǎng)： 將大腸桿菌用________在無菌操作下接種至三角錐形瓶中的________培養(yǎng)基中，在________搖床振蕩培養(yǎng)________，完成大腸桿菌的培養(yǎng)。 (4)將菌液在________培養(yǎng)基上進行________分離： 從前一步培養(yǎng)得到的菌液中獲取菌種，用________以__________法接種至第二步所制得的__________培養(yǎng)基中，在________℃恒溫箱中培養(yǎng)________h后觀察菌落。 (5)菌種保存： 在無菌操作下將________用________取出，再用________法接種在________上，________培養(yǎng)________后，________冰箱保存。 3．分離實驗的結果及相應結論： 觀察中若看到在________的末端出現(xiàn)________，則表明菌已被分離了。 4．大腸桿菌分離的用途：________的通用方法，也是用于________的最簡便方法之一。 答案：1.(1)擴增　液體　(2)分離　固體平面　劃線 2．(1)高壓鍋　1 kg　15　(2)三角瓶　培養(yǎng)皿　60 ℃ 固體　超凈臺　培養(yǎng)皿　固體平面　(3)斜面　三角瓶　液體 接種環(huán)　液體　37 ℃　12 h　(4)固體平面　劃線　接種環(huán) 劃線　固體平面　37　12～24　(5)單菌落　接種環(huán)　劃線　斜面　37 ℃　24 h　4 ℃ 3．劃線　不連續(xù)的單個菌落 4．消除污染雜菌　篩選高表達量菌株 核心解讀HEXINJIEDU 1．微生物、細菌與大腸桿菌之間有怎樣的關系？ (1)概念內涵：其關系圖解見下 (2)結構上：三者都是結構簡單，形體微小的生物，但是從細胞角度看其結構是不同的，具體如下： 2．培養(yǎng)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基中有各種物質，為什么選擇這些物質，這些物質有什么作用呢？ (1)人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出了供其生長繁殖的營養(yǎng)基質——培養(yǎng)基。雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有五大營養(yǎng)要素，即水、無機鹽、碳源(提供碳元素)、氮源(提供氮元素)和生長因子(不同的細菌需要的各不相同，有物種差異，它主要補充自身不能合成的或合成能力較弱的，但卻是生長繁殖必需的物質)。見下表： 微生物的營養(yǎng)要素 定義 功能 類型 化合物類型 常用物質 碳源 凡可構成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質稱為碳源 構成細胞物質，供給微生物生長發(fā)育所需要的能量 無機碳(自養(yǎng)型微生物用) 無機物 CO2、NaHCO3、CaCO3等 有機碳(異養(yǎng)型微生物用) 蛋白質、核酸類 牛肉膏、蛋白胨、花生粉餅、明膠、氨基酸等 糖類脂質等 葡萄糖、蔗糖、淀粉等 氮源 凡是構成微生物的細胞物質或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質稱為氮源 主要是提供合成原生質和細胞其他結構的原料，一般不作能源 無機氮 銨鹽 NH3、(NH4)2SO4 硝酸鹽 KNO3 N2 空氣 有機氮 牛肉膏、蛋白胨、醇母膏、尿素、明膠等 生長因子 一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳、氮源自行合成的所需極微量的有機物 一般是酶和核酸的組成成分 酵母膏、玉米漿、黃豆餅粉、動植物組織液、麥芽汁等，復合維生素 水 作用：組成成分；反應介質；物質運輸媒體；熱的良導體 無機鹽 作用：維持滲透壓、pH等 (2)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基 微生物的營養(yǎng)要素 本實驗中大腸桿菌LB培養(yǎng)基配方 培養(yǎng)基配方與微生物營養(yǎng)要素的對應關系 LB液體培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基 氮源、 碳源、 無機鹽、 生長因子、 水 瓊脂1 g 蛋白胨0.5 g 主要提供大腸桿菌的氮源、碳源需求 酵母提取物0.25 g 主要提供生長因子 NaCl　0.5 g 提供無機鹽 水　50 mL 提供水 (3)此外配方中還要注意pH等。 3．該實驗中這些操作的原因 (1)三角錐形瓶中的LB固體培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60 ℃左右時，才用來轉移和分裝，制成固體平面培養(yǎng)基，為什么？你用什么簡易方法快速估計該溫度？ 因為三角錐形瓶中的LB固體培養(yǎng)基中有瓊脂，它在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，當冷卻到60 ℃左右時，不會因溫度過高燙手而不易操作；也不會因為溫度過低而使三角錐形瓶中的培養(yǎng)基凝固，最終無法轉移分裝制成新的平面培養(yǎng)基。 簡易估計溫度的方法：可以用手觸摸滅菌后的三角錐形瓶，感覺錐形瓶由燙手轉為剛剛不燙手時，則說明已經(jīng)冷卻到60 ℃左右了。 (2)進行恒溫培養(yǎng)時，為什么要將培養(yǎng)皿倒置？ 恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結成水滴留在蓋子上；如果正放培養(yǎng)皿，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并且擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則菌落中的菌會隨水擴散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達不到分離的目的，培養(yǎng)皿中的菌落還有可能被蓋子上掉落的水給污染。 (3)將大腸桿菌用接種環(huán)自斜面轉移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，為什么接種環(huán)必須先深入到斜面冷卻后，才能再取斜面上的菌體？ 接種環(huán)在取菌體前曾在酒精燈火焰上灼燒滅菌，一直灼燒至紅，溫度很高，若不冷卻就直接用其取斜面上的菌體，菌體可能因為接觸高溫接種環(huán)而死亡，導致大腸桿菌的轉移培養(yǎng)失敗。 (4)用劃線法分離大腸桿菌中，第一次和隨后的幾次劃線前都要灼燒接種環(huán)，它們的原因一樣嗎？在劃線結束后仍然要灼燒接種環(huán)這又是為什么呢？ 雖然每次灼燒都是為了滅菌，但所滅的菌種和原因卻不一樣。 灼燒接種環(huán)的時間 消滅的菌體 原因 第一次劃線前 其他雜菌 防止其他雜菌的侵入而造成污染 隨后的幾次劃線前 上次劃線結束后殘留在接種環(huán)上的實驗菌(本實驗為：大腸桿菌) 為了使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌來自上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，最終獲得單個菌落，實現(xiàn)菌的分離 最后一次劃線結束后 為了防止實驗菌殘留于接種環(huán)而污染環(huán)境和感染實驗人員 (5)用劃線法分離大腸桿菌時，每次的劃線是怎么樣的？對隨后的劃線的起點有什么要求？為什么這樣要求呢？ 每一次的劃線 依次的2次劃線之間的關系 各次劃線的分布 圖形輔助理解 劃線的要求 不能出現(xiàn)線條的重疊 第二次以及隨后的劃線操作，總是從上一次劃線的末端開始 不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連 這樣要求的原因 使線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少 因為劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到有單個細菌繁殖而來的單菌落 若相連，則可能最后一次劃線末端處的細菌與第一次的疊加，細菌的數(shù)目不是最少的，不能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終將很難獲得單菌落 4．消毒與滅菌一樣嗎？ 概念 常用方法 應用的范圍 消毒 使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min 一般物品 巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 對于一些不耐高溫的液體，如牛奶 化學藥劑消毒法 如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等 滅菌 使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼燒滅菌：酒精燈火焰 接種工具的滅菌 干熱滅菌：160～170 ℃下滅菌1～2 h 玻璃器皿、金屬工具的滅菌 高壓蒸汽滅菌：121 ℃條件下，滅菌15～30 min 培養(yǎng)基及容器的滅菌 5.本實驗中還需要了解哪些基礎知識才更便于掌握和理解呢？ (1)牛肉膏蛋白胨的知識 牛肉膏和蛋白胨來源于動物原料，含有糖、維生素和有機氮等營養(yǎng)物質。 1 000 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成 培養(yǎng)基組分 提供的主要營養(yǎng) 牛肉膏　5 g 碳源、磷酸鹽和維生素 蛋白胨　10 g 氮源和維生素 NaCl　5 g 無機鹽 H2O　定容至1 000 mL 氫元素、氧元素 　　(2)巴氏消毒法的知識 巴氏消毒法也稱做低溫消毒法。 日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法。在100 ℃煮沸 5～6 min 可以殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢。對于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。 題例領悟TILILINGWU 【例題1】 下列操作屬于滅菌的是(　　) A．用酒精擦拭實驗人員的雙手 B．用氯氣處理水源 C．將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至紅 D．殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物 解析：此題考查對微生物實驗中滅菌的理解。對微生物培養(yǎng)來說，滅菌操作十分重要，其目的就是為了獲得純凈的培養(yǎng)物，其關鍵是防止外來一切雜菌的入侵，不僅僅是對人體有害的微生物。滅菌操作一般使用強烈的物化因素(如：灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌等)。而不是使用較為溫和的物化方法。 答案：C 消毒與滅菌是不同的。兩者除了在物化手段上是否強烈外，所消滅的微生物內容也是不同的。滅菌是消除一切雜菌，而消毒僅僅殺死對人體有害的微生物。消毒往往無法消滅微生物的芽孢和孢子。 【例題2】 下列關于平板劃線的操作及敘述，正確的是 … (　　) A．灼燒接種環(huán)之后，為避免其他雜菌的干擾，應立即伸入菌液取菌種 B．劃線結束后，為避免實驗菌污染環(huán)境和感染操作者，所以必須再次灼燒接種環(huán) C．在第一次劃線前灼燒接種環(huán)和每次劃線前灼燒接種環(huán)的目的相同 D．劃線時最后一區(qū)域一定要與第一區(qū)域相連，達到首尾相接 解析：此題考查對劃線法分離大腸桿菌的掌握。這是本實驗的一大重點和難點。A的操作是錯誤的，灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后方能取菌種，以免溫度太高殺死菌種。B的操作完全正確。C的敘述是錯誤的，它們的灼燒目的完全不同，第一次劃線前的灼燒是為了殺死其他雜菌，保證實驗菌的純凈，而隨后的灼燒卻是為了殺死殘留于接種環(huán)上的實驗菌，保證實驗菌隨劃線次數(shù)的增加而減少，每次劃線的菌種來自上一次劃線的末端。D的操作也是不正確的，不應該相連，這樣才能使最后一次劃線不受第一次劃線的干擾。 答案：B 大腸桿菌的分離所采用的就是劃線分離法。這一方法十分重要。我們不僅要知其每一步具體的操作，還要知其所以然，還要關注注意事項，避免踏入誤區(qū)。 隨堂訓練SUITANGXUNLIAN 1細菌培養(yǎng)過程中分別采用了高壓蒸汽、酒精、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌(　　) A．接種針、手、培養(yǎng)基　　B．高壓鍋、手、接種針 C．培養(yǎng)基、手、接種針 D．接種針、手、高壓鍋 答案：C　解析：滅菌是微生物培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)。其中高壓蒸汽是為了殺滅培養(yǎng)基中的雜菌；酒精擦拭雙手，是滅手上的雜菌；而接種針在火焰上灼燒，就是為了滅接種針上的菌。故C選項是正確的。 2下列關于倒平板的操作姿勢的敘述中，正確的是(　　) A．右手無名指及小指夾持含有固體培養(yǎng)基的三角瓶封口膜 B．右手大拇指、食指拿著三角瓶 C．左手拿著培養(yǎng)皿，蓋子放于桌子上 D．倒平板時，為防止溫度過高，暫時熄滅酒精燈 答案：A　解析：倒平板技術是微生物技術中的基本技術。只有A是正確的。B中手指姿勢錯誤。C錯在培養(yǎng)皿蓋放在桌上了。D中熄滅酒精燈不對，整個過程都需在酒精燈火焰旁完成。