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目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,1.能正確選擇材料對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取。 2.能說出DNA的物理、化學(xué)性質(zhì)。 3.能記住DNA粗提取與鑒定的原理。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,一、DNA的提取 1.提取生物大分子的基本思路 選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。對(duì)于DNA的粗提取而言,就是要利用DNA與 RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異,提取DNA,去除其他成分。,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,2.DNA粗提取的原理 (1)DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,利用這一特點(diǎn),選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解,而使雜質(zhì)沉淀,或者相反,以達(dá)到分離目的。 在物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液中,DNA的溶解度最小。 此外,DNA不溶于酒精溶液,但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)能溶于酒精溶液。利用這一原理,可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。 (2)DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì),但是對(duì)DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60~80 ℃的高溫,而DNA在80 ℃以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜,但對(duì)DNA沒有影響。,,,,,,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,二、DNA的鑒定 在沸水浴的條件下,DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色,因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1.實(shí)驗(yàn)材料的選取 原則上,凡是含有DNA的生物材料都可以考慮,但是,選用 DNA含量相對(duì)較高的生物組織,成功的可能性更大。 生活在牧區(qū)的人們,采集牛、羊和馬血比較方便,他們用牛、羊、馬血作為提取DNA的實(shí)驗(yàn)材料合適嗎?為什么? 提示:不合適。因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中無細(xì)胞核,而DNA主要存在于細(xì)胞核中,血液中白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目少,因此DNA含量少,在實(shí)驗(yàn)中很難提取到。,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,2.破碎細(xì)胞,獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易,以雞血為例,在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水,同時(shí)用玻璃棒攪拌,過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞,需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如,提取洋蔥的DNA時(shí),在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽,進(jìn)行充分的攪拌和研磨,過濾后收集研磨液。 為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂? 提示:雞血細(xì)胞在蒸餾水中會(huì)發(fā)生滲透吸水,以致破裂。,,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,3.去除濾液中的雜質(zhì) 最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì),需要進(jìn)一步提純DNA。 方案一:利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的不同,在濾液中加入NaCl,使NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為2 mol/L,過濾除去不溶的雜質(zhì);再調(diào)節(jié)NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為 0.14 mol/L,析出DNA,過濾去除溶液中的雜質(zhì);再用物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 方案二:利用蛋白酶分解蛋白質(zhì),不分解DNA的特點(diǎn),在濾液中加入嫩肉粉,嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)。 方案三:利用蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同的特點(diǎn),將濾液放在 60~75 ℃的恒溫水浴箱中保溫10~15 min,過濾獲得DNA濾液。,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,4.DNA的析出與鑒定 將處理后的溶液過濾,加入與濾液體積相等的、冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%),靜置2~3 min,溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物,這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸去上面的水分。 取兩支20 mL的試管,各加入物質(zhì)的量濃度為2 mol/L 的NaCl溶液5 mL,將絲狀物放入其中一支試管中,用玻璃棒攪拌,使絲狀物溶解。然后,向兩支試管中各加入4 mL 的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?將試管置于沸水中加熱5 min,待試管冷卻后,比較兩支試管中溶液顏色的變化,看看溶解有DNA的溶液是否變藍(lán)。,,,,,,,,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,四,四、操作提示 1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),每100 mL血液中需要加入3 g檸檬酸鈉,防止血液凝固。 2.加入洗滌劑后,動(dòng)作要輕緩、柔和,否則容易產(chǎn)生大量的泡沫,不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí),動(dòng)作要輕緩,以免加劇DNA分子的斷裂,導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。 3.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用,否則會(huì)影響鑒定的效果。,,,,,,,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,一、DNA粗提取的原理,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,二、實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵及注意事項(xiàng) 1.實(shí)驗(yàn)材料選用雞血細(xì)胞液,而不用雞全血的主要原因是遺傳物質(zhì)DNA主要存在于血細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。 2.盛放雞血細(xì)胞液的容器,最好是塑料容器。玻璃表面帶電荷,雞血細(xì)胞破碎后釋放出的DNA中的磷酸基也帶電荷,因而容易被玻璃容器吸附,提取到的DNA就會(huì)更少。因此,實(shí)驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管,以減少提取過程中DNA的損失。 3.破碎細(xì)胞釋放DNA過程中,若實(shí)驗(yàn)材料是血細(xì)胞,加水后必須充分?jǐn)嚢?否則血細(xì)胞核不會(huì)充分破碎,溶解出的DNA量就會(huì)減少;若實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞,需先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,4.洗滌劑是多組分的混合物,在嚴(yán)格的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中很少使用。實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA時(shí),通常使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)或吐溫等化學(xué)試劑。 5.實(shí)驗(yàn)過程中兩次加入蒸餾水,操作目的各不相同:第一次向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水,目的是使血細(xì)胞通過吸水漲破,釋放出核內(nèi)的DNA。第二次向溶有DNA的濾液中加蒸餾水,目的是稀釋NaCl溶液,使其物質(zhì)的量濃度降至0.14 mol/L,最終使大量DNA析出。 6.實(shí)驗(yàn)過程中幾次過濾的目的:破碎雞血細(xì)胞后過濾的目的是除去破裂的細(xì)胞膜等物質(zhì);將溶有DNA的高濃度NaCl溶液過濾的目的是除去不溶于高濃度NaCl溶液的雜質(zhì);用低濃度NaCl溶液析出DNA后過濾的目的是除去溶于低濃度NaCl溶液中的雜質(zhì)。 特別提醒過濾時(shí)采用單層紗布或尼龍布,不能使用濾紙,以減少DNA的損失。,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,7.析出的DNA絲狀物用玻璃棒攪拌時(shí),要緩緩沿一個(gè)方向攪拌,而且不能直接觸碰燒杯壁,以便獲得較完整的DNA分子。 8.用冷酒精濃縮和沉淀DNA時(shí),所用的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精必須充分預(yù)冷后才能使用,冷酒精與含有DNA的NaCl溶液的體積比是1∶1。 特別提醒低溫可抑制核酸水解酶的活性,防止其降解DNA;低溫可降低分子的運(yùn)動(dòng),DNA易于形成沉淀析出;低溫有利于增加DNA分子柔韌性,減少斷裂。 9.粗提取所得的絲狀物的主要成分是DNA,可用二苯胺作為鑒定試劑。若出現(xiàn)藍(lán)色,說明實(shí)驗(yàn)基本成功;如果不出現(xiàn)藍(lán)色,可能是因?yàn)樗崛〉腄NA含量低,或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤。,知識(shí)梳理,典例透析,題型一,題型二,題型一 DNA提取、分離與鑒定原理 【例題1】 現(xiàn)代生物學(xué)已向兩個(gè)方面發(fā)展,宏觀研究的水平為生態(tài)系統(tǒng)水平,微觀研究的水平為分子水平,對(duì)于分子的研究,其物質(zhì)的提取和分離顯得尤為重要。下面是關(guān)于DNA分子的提取和分離的相關(guān)問題,請(qǐng)回答下面的問題。 (1)在提取菜花細(xì)胞中的DNA時(shí),采用的是研磨法,為什么不能像雞血那樣,用蒸餾水使其破裂? (2)在提取實(shí)驗(yàn)過程中用到兩種濃度的NaCl溶液,說明其作用。 ①物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液: 。 ②物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液: 。 (3)以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),每100 mL血液中加入3 g檸檬酸鈉的作用是 。 (4)鑒定DNA所用的試劑是 。,知識(shí)梳理,典例透析,題型一,題型二,解析:(1)DNA分子提取中理想的材料為富含DNA的細(xì)胞,雞血紅細(xì)胞具有細(xì)胞核,放入蒸餾水中細(xì)胞會(huì)漲破釋放出DNA,而植物細(xì)胞中含有細(xì)胞壁,需要用研磨法破壞細(xì)胞壁。 (2)實(shí)驗(yàn)過程中用到兩種濃度的NaCl溶液,物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液用于溶解DNA,而物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液會(huì)使DNA析出。 (3)為了防止血液凝固,應(yīng)加入檸檬酸鈉。 (4)鑒定DNA所用的試劑為二苯胺試劑。 答案:(1)植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁,不會(huì)吸水漲破,只有加入洗滌劑和食鹽進(jìn)行充分的研磨,才能釋放出DNA。 (2)①溶解DNA分子,過濾并除去不溶于該濃度NaCl溶液的雜質(zhì) ②使DNA分子析出,過濾并除去溶于該濃度NaCl溶液中的雜質(zhì) (3)防止血液凝固 (4)二苯胺試劑,知識(shí)梳理,典例透析,題型一,題型二,題型二 DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中的操作 【例題2】 下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述,錯(cuò)誤的是( ) A.酵母和菜花均可作為提取DNA的材料 B.DNA既溶于物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水 C.向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水?dāng)嚢?可見玻璃棒上有白色絮狀物 D.DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱,冷卻后呈藍(lán)色 解析:本實(shí)驗(yàn)可選含有DNA的生物材料,A項(xiàng)正確;DNA在物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液和蒸餾水中溶解度較大,在物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小,呈白色絮狀,B項(xiàng)正確,C項(xiàng)錯(cuò)誤;鑒定DNA的方法是在DNA溶液中加入二苯胺試劑,并沸水浴加熱,冷卻后呈藍(lán)色,D項(xiàng)正確。 答案:C,