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實驗三：PCR擴增檢測乙肝病毒,1,乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國發(fā)病率很高，HBV的檢測極其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動機。,2,PCR技術(shù)可以檢測出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)已成為公認的對病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。,3,一、實驗?zāi)康?.掌握PCR技術(shù)擴增的原理2.熟悉PCR擴增檢測乙肝病毒的基本操作過程。,,4,二、實驗原理聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴增技術(shù)，它包括三個基本過程：,5,,,1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?.退火：急速降溫使引物和互補模板在局部形成雜交鏈3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點的延伸反應(yīng),6,,,,模板DNA,,高溫變性,,,,,,,,低溫退火,,,,引物,,適溫延伸,,,,,,經(jīng)過25-35次循環(huán)后，目的片段擴增2n倍,兩條子代DNA,,一次循環(huán),,,,Tap酶,5’,3’,3’,5’,,3’,5’,5’,3’,5’,3’,7,三、主要器材及試劑1.主要器材：,9700型PCR儀,電泳槽、電泳儀,8,,紫外分析儀,臺式高速離心機,9,2.主要試劑：,10,四、操作步驟1.標本處理：取患者血清40μl，加入DNA提取液40μl，沸水浴10分鐘，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。,11,2.加樣：加入提取好的標本4μl，6000轉(zhuǎn)離心10秒。,,12,三個擴增步驟溫度及時間,循環(huán)次數(shù)：25次,,3.PCR儀上擴增：,13,,,PCR儀上擴增,,,加入標本,離心,6000轉(zhuǎn)離心10秒,14,4.電泳檢測：①制備2%瓊脂糖凝膠,2%瓊脂糖的制備：,電泳槽的準備：,,,,稱取0.8g瓊脂糖,,40mlTBE電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解,,加入,冷卻,60℃左右,加入溴乙啶EB20μl,,,,倒膠,15,②加樣：取擴增后的產(chǎn)物10ul點樣于凝膠孔,``,,取樣,點樣,16,③電泳：點樣端接“-”，穩(wěn)壓，50V，電泳30分鐘。五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色條帶則為HBV陽性,,HBV陽性,,HBV陰性,,,,HBV陽性對照,,HBV陰性對照,正極,負極,,點樣孔,,17,五、注意事項1.試劑盒內(nèi)陽性標本及DNA提取液使用前需充分融化離心。2.反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時從反應(yīng)管底部吸液。3.EB為強致癌物，操作過程應(yīng)注意防護。4.注意無菌操作，以免出現(xiàn)假陽性。,18,Thankyou!,19,