2019年高考生物 考點一遍過 考點80 PCR技術(含解析).doc
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考點80 PCR技術 1.PCR原理 (1)細胞內(nèi)DNA復制條件 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 DNA聚合酶 打開DNA雙螺旋 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3’端起點 (2)細胞內(nèi)DNA復制過程 ①DNA的兩條鏈是反向平行的,通常將DNA的羥基末端稱為3’端,而磷酸基團的末端稱為5’端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3’端延伸DNA鏈,因此,DNA復制需要引物。DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸。 ②在DNA的復制過程中,復制的前提是雙鏈解開。在體外可通過控制溫度來實現(xiàn)。在80~100 ℃的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開,這個過程稱為變性。PCR利用了DNA的熱變性原理,通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高,導致DNA聚合酶失活,后來耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應用,大大增加了PCR的效率。 ③PCR反應需要在一定的緩沖溶液中進行,需提供:DNA模板,分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物,四種脫氧核苷酸,耐熱的DNA聚合酶,同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。 2.PCR的反應過程 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為變性、復性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始,上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合,進行DNA的延伸,這樣,DNA聚合酶只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列成指數(shù)擴增。 3.實驗操作 (1)PCR反應體系:緩沖液、DNA模板,四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、兩種RNA引物、水。 (2)實驗操作步驟 ①按照PCR反應體系配方配制反應液; ②將PCR反應體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管(0.5 mL)中; ③將微量離心管放到PCR儀中; ④設置PCR儀的工作參數(shù); ⑤DNA在PCR儀中大量擴增。 考向 PCR的反應過程 1.聚合酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。PCR過程一般經(jīng)歷下述30多次循環(huán):95 ℃下使模板DNA變性、解鏈→55 ℃下復性(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→72 ℃下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關PCR過程的敘述中不正確的是 A.變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵,也可利用解旋酶實現(xiàn) B.復性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補配對原則完成的 C.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D.PCR與細胞內(nèi)DNA復制相比所需酶的最適溫度較高 【參考答案】C 【試題解析】變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵,解旋酶也具有該作用,A正確。復性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補配對原則完成的,B正確。延伸是合成DNA的過程,所以該過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種脫氧核糖核苷酸,C錯誤。PCR與細胞內(nèi)DNA復制相比所需酶的最適溫度較高,因為PCR過程需要高溫變性,即使在復性時的溫度也比較高,D正確。 2.利用PCR技術擴增目的基因,其原理與細胞內(nèi)DNA復制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段,它是子鏈合成延伸的基礎。下列敘述錯誤的是 A.用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列 B.設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連 C.退火溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產(chǎn)物 D.第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16 【答案】D 1.PCR(多聚酶鏈式反應)技術是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術,如圖表示合成過程。下列說法錯誤的是 A.甲過程高溫使DNA變性解旋,該過程不需要解旋酶的作用 B.丙過程用到的酶在高溫下失活,因此在PCR擴增時需要再添加 C.如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記,游離的脫氧核苷酸不做標記,循環(huán)3次后,在形成的子代 DNA中含有15N標記的DNA占25% D.PCR中由堿基錯配引起的變異屬于基因突變 2.下列有關PCR技術中引物的敘述,正確的是 A.引物是一小段DNA分子或雙鏈RNA分子 B.擴增一個DNA分子至少需要的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目 C.兩種引物之間能夠發(fā)生堿基互補配對 D.DNA聚合酶只能從引物的5'端連接脫氧核苷酸 3.利用PCR技術將某DNA分子擴增n代的過程中,下列敘述錯誤的是 A.引物越短,PCR出來的非目標DNA就越多 B.適溫延伸過程中,需要提供ATP C.引物中G/C含量越高,退火溫度越高 D.共有2n-1對引物參與子代DNA分子的合成 4.多聚酶鏈式反應(PCR技術)是體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法,其簡要過程如圖所示。下列關于PCR技術敘述不正確的是 A.PCR技術是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術 B.反應中新合成的DNA可以作為下一輪反應的模板 C.每擴增一次溫度發(fā)生90℃→75℃→55℃變化 D.應用PCR技術與DNA分子雜交技術可以檢測基因突變 5.小鼠雜交瘤細胞表達的單克隆抗體用于人體試驗時易引起過敏反應,為了克服這個缺陷,可選擇性擴增抗體的可變區(qū)基因(目的基因)后再重組表達。下列相關敘述正確的是 A.設計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列 B.用PCR方法擴增目的基因時需要知道基因的全部序列 C.PCR體系中G—C堿基對含量將影響使DNA解鏈的所需溫度 D.PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶 6.用PCR技術將DNA分子中的A1片段進行擴增,設計了引物Ⅰ、Ⅱ,其連接部位如圖所示,x為某限制酶識別序列。擴增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的 A. B. C. D. 7.用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導入目的基因時,得到以下電泳圖譜。其中:1號為DNA標準樣液(Marker),10號為蒸餾水,PCR過程中加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析不合理的是 A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250~500 bp之間 B.3號樣品為不含目的基因的載體DNA C.9號樣品對應植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株 D.10號可確定反應體系等對結(jié)果沒有干擾 8.根據(jù)某基因上游和下游的堿基序列,設計合成了用于該基因PCR的兩段引物(單鏈DNA)。引物與該基因變性DNA(單鏈DNA)結(jié)合為雙鏈DNA的過程稱為復性。下圖是兩引物的Tm(引物熔解溫度,即50%的引物與其互補序列形成雙鏈DNA分子時的溫度)測定結(jié)果,下列敘述錯誤的是 A.通常引物1和引物2不能有堿基互補配對關系 B.兩引物分別是子鏈延伸的起點,并可以反復利用 C.若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同,推測引物2的GC含量較高 D.復性所需溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度等因素 9.以下為形成cDNA過程和PCR擴增過程示意圖。據(jù)圖分析,下列說法正確的是 A.④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合 B.催化①過程的酶是DNA聚合酶 C.催化①②⑤過程的酶都必須能耐高溫 D.過程③需要解旋酶 10.在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品DNA進行分析,PCR技術能快速擴增DNA片段,在幾個小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝,有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關問題。 (1)在相應的橫線上寫出引物Ⅱ,并在復性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。__________________。 (2)在相應的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。________。 (3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標記,請分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點:________,循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為________。 (4)PCR反應過程的前提條件是________,PCR技術利用了DNA的________原理解決了這個問題。 (5)在對樣品DNA分析過程中發(fā)現(xiàn),DNA摻雜著一些組蛋白,要去除這些組蛋白可加入的物質(zhì)是___________________。 11.(2018江蘇卷)為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶,研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因(1656個堿基對),利用基因工程大量制備琢α-淀粉酶,實驗流程見下圖。請回答下列問題: (1)利用PCR技術擴增α-淀粉酶基因前,需先獲得細菌的_________。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接,需在引物的____端加上限制性酶切位點,且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點,主要目的是______________。 (3)進行擴增時,反應的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設定,下列選項中_______的設定與引物有關,________的設定與擴增片段的長度有關。(填序號) ①變性溫度 ②退火溫度 ③延伸溫度 ④變性時間 ⑤退火時間 ⑥延伸時間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA的部分堿基序列: 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含___個密碼子,如虛線框后的序列未知,預測虛線框后的第一個密碼子最多有__種。 (5)獲得工程菌表達的α-淀粉酶后,為探究影響酶活性的因素,以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性,結(jié)果如下: 緩沖液 50mmol/LNa2HPO4-KH2PO4 50mmol/LTris-HCl 50mmol/LGly-NaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實驗結(jié)果,初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為______。 12. (2016天津卷)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的醫(yī)用價值,只能從人血漿中制備。下圖是以基因工程技術獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑。 (1)獲取HSA基因,首先需采集人的血液,提取_____________合成總cDNA,然后以cDNA為模板,采用PCR技術擴增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴增方向,請用箭頭在方框內(nèi)標出另一條引物的位置及擴增方向。 (2)啟動子通常具有物種及組織特異性,構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體,需要選擇的啟動子是_____________(填寫字母,單選)。 A.人血細胞啟動子 B.水稻胚乳細胞啟動子 C.大腸桿菌啟動子 D.農(nóng)桿菌啟動子 (3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細胞的過程中,需添加酚類物質(zhì),其目的是_____________________。 (4)人體合成的初始HSA多肽,需要經(jīng)過膜系統(tǒng)加工形成正確空間結(jié)構(gòu)才能有活性。與途徑II相比,選擇途徑I獲取rHSA的優(yōu)勢是_______________________________________。 (5)為證明rHSA具有醫(yī)用價值,須確認rHSA與_________________的生物學功能一致。 1.【答案】B 【解析】PCR中解旋是通過高溫進行的,故甲過程高溫使DNA變性解旋,該過程不需要解旋酶的作用,A正確;丙過程用到的酶為耐高溫的DNA聚合酶,在高溫下不會失活,因此在PCR擴增時不需要再添加,B錯誤;如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記,游離的脫氧核苷酸不做標記,循環(huán)3次后,形成的DNA分子為8個,而含有15N標記的DNA分子為2個,故在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占25%,C正確;PCR中由堿基錯配引起的變異屬于基因突變,D正確。 2.【答案】B 3.【答案】B 【解析】引物越短,PCR出來的非目標DNA就越多,A正確;適溫延伸過程中,不需要提供ATP,B錯誤;引物中G/C含量越高,則DNA模板中G/C的含量也高,高溫變性的溫度就越高,退火溫度也越高,C正確;PCR技術的原理是DNA復制,根據(jù)DNA分子半保留復制特點可知,共有2n-1對引物參與子代DNA分子的合成,D正確。 4.【答案】C 【解析】PCR技術是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術,能以少量DNA為模板,在短時間內(nèi)復制出大量的DNA,A正確;PCR技術需要模板DNA,且反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板,B正確;每擴增一次溫度發(fā)生95℃→55℃→72℃變化,C錯誤;應用PCR技術與DNA分子雜交技術可以檢測基因突變,D正確。 5.【答案】C 【解析】設計擴增目的基因的引物時,要考慮表達載體相關序列,從而保證目的的基因能與表達載體相連接及正常表達,A錯誤;用PCR方法擴增目的基因的前提是:要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物,因此不需要知道基因的全部序列,B錯誤;在每個雙鏈DNA分子中,堿基對A與T之間有2個氫鍵,C與G之間有3個氫鍵,且DNA分子含有的氫鍵數(shù)越多,其熱穩(wěn)定性就越高,因此PCR體系中G—C堿基對含量將影響使DNA解鏈的所需溫度,C正確;PCR體系中一定要添加耐高溫的熱穩(wěn)定DNA聚合酶,而從受體細胞內(nèi)提取的DNA聚合酶不耐高溫,D錯誤。 6.【答案】D 【解析】利用PCR技術將DNA分子中的A1片段進行擴增,當引物與母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后,子鏈延伸的方向總是從5′端到3′端,據(jù)此依題意和圖示分析可知,A、B、C均錯誤,D正確。 7.【答案】B 8.【答案】B 【解析】通常引物1和引物2不能有堿基互補配對關系,以免二者結(jié)合,A項正確;兩引物參與構(gòu)成子鏈,不能反復利用,B項錯誤;若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同,引物2的熔解溫度較高,推測其GC含量較高,C項正確;結(jié)合以上分析可知,復性所需溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度等因素,D項正確。 9.【答案】A 【解析】分析題圖:圖示為形成cDNA過程和PCR擴增過程示意圖,其中①是由RNA形成單鏈DNA的過程,為逆轉(zhuǎn)錄過程;②是由單鏈DNA合成雙鏈DNA的過程,是DNA分子復制過程;③④⑤是多聚酶鏈式反應擴增DNA片段,其中③是變性、④是復性、⑤是延伸階段。④為復性過程,發(fā)生的變化是引物與互補DNA鏈結(jié)合,A正確;①為逆轉(zhuǎn)錄過程,該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化,B錯誤;圖中②⑤過程為DNA復制,這兩個過程都需要DNA聚合酶的催化,其中⑤過程進行的溫度是70~75℃,因此催化該過程的DNA聚合酶能耐高溫,但催化②過程的酶不耐高溫,C錯誤;過程③為高溫解鏈,該過程不需要解旋酶,D錯誤。 10.【答案】(1)5′—G—A—OH(或HO—A—G—5′) (2) (3)每個DNA分子各有一條鏈含32P 1/2n (4)DNA解旋 熱變性 (5)蛋白酶 【解析】(1)由圖可知,引物Ⅱ為5’-G-A-OH。(2)循環(huán)一次后生成的DNA分子如下:。(3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標記,根據(jù)DNA半保留復制特點可知,循環(huán)一次后,每個DNA分子各有一條鏈含32P,循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為2/2n+1=1/2n。(4)PCR反應過程的前提條件是DNA解旋,PCR技術利用DNA的熱變性原理解決了這個問題。(5)在對樣品DNA進行分析的過程中發(fā)現(xiàn),DNA摻雜著一些組蛋白,根據(jù)酶的專一性原理,要去除這些組蛋白可加入蛋白酶。 11.【答案】(1)基因組DNA (2)5’ 使DNA片段能定向插入表達載體,減少自連 (3)② ⑥ (4)8 13 (5)pH為8.5,緩沖液為50mmol/LTris-HCl 12.【答案】(1)總RNA(或mRNA) (2)B (3)吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞,有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化 (4)水稻是真核生物,具有膜系統(tǒng),能對初始rHSA多肽進行高效加工 (5)HSA- 配套講稿:
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