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.,基因工程原理,Principle of Gene Engineering,第一章,.,.,,基因研究的發(fā)展階段：,染色體遺傳學(xué),分子生物學(xué),反向生物學(xué),50s,70s,染色體水平,DNA水平,DNA重組,1909年，丹麥W. Johannsen，Gene專(zhuān)業(yè)名詞誕生，“給予生命”,1857－1864：孟德?tīng)柾攵闺s交試驗(yàn)（遺傳因子的獨(dú)立分配規(guī)律） 1910年：摩爾根果蠅遺傳學(xué)研究 （遺傳的染色體理論）,,1944年：Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA） 1953年：Watson-Crick DNA雙螺旋模型,.,.,,,,,.,.,,學(xué)習(xí)內(nèi)容,概論 DNA重組（限制性?xún)?nèi)切酶） 運(yùn)輸工具——基因克隆載體 目的基因的制備 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 外源基因的表達(dá) 基因工程的應(yīng)用,.,.,,基本要求,掌握基因克隆的基本工具，特別是不同的載體。 克隆基因的基本方法。 怎樣利用基因重組技術(shù)研究基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控。 利用基因工程生產(chǎn)重組蛋白，基因工程在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。 能夠設(shè)計(jì)一個(gè)基因克隆的程序。 PCR技術(shù)基本原理和應(yīng)用 能夠根據(jù)酶切結(jié)果判讀酶切圖譜，以及判讀DNA序列的能力。,.,.,《基因工程》，龍敏南 等著，科學(xué)出版社，普通高等教育“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材,.,.,,參考書(shū),Gene cloning, T.A. Brown. Third edition. 基因工程原理，吳乃虎編著，科學(xué)出版社 基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社。 植物基因工程原理與技術(shù)，王關(guān)林，方宏筠主編，科學(xué)出版社。 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟楓等譯，科學(xué)出版社。,,.,.,第一章 緒論——基因工程概況,1.1引言 1.1.1基因工程含義 ——指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。 基因工程英文： genetic engineering, gene manipulation, recombinant DNA technique, gene cloning, molecular cloning,.,.,目的基因的制備 DNA重組（限制性?xún)?nèi)切酶） 運(yùn)輸工具——基因克隆載體 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 外源基因的表達(dá),基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。,關(guān)鍵要素：,.,.,1.1.2 基因工程理論依據(jù),基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)：DNA 基因可切割 基因可轉(zhuǎn)移 多肽——基因 遺傳密碼通用性：三聯(lián)密碼 基因遺傳,.,.,1.1.3 基因工程研究的基本路線(xiàn),基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史 （1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：,1944, Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。 DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。 1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學(xué)說(shuō)” DNA——RNA-——蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問(wèn)題。,,.,.,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史 （1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：,1944, Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。 DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。 1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學(xué)說(shuō)” DNA——RNA-——蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問(wèn)題。,,.,.,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史 （1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：,1944, Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。 DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。 1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學(xué)說(shuō)” DNA——RNA-——蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問(wèn)題。,,.,.,.,.,DNA分子的體外切割與連接技術(shù)1970年，Smith等在流感嗜血桿菌中分離純化了核酸限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ；1972年，EcoR Ⅰ。 DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù) 基因工程載體pBR322和pUC13等載體。 Cohen發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pSC101，并作為基因工程的載體使用.,（2）技術(shù)上的三大發(fā)明：,.,.,（3）基因工程的誕生,1972年,美國(guó)斯坦福大學(xué)的 P.Berg 第一次實(shí)現(xiàn)了DNA 體外重組。,.,.,1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer，標(biāo)志著基因工程的誕生：,.,.,Cohen體外重組實(shí)驗(yàn)的意義：,1. pSC101質(zhì)?？梢宰鳛榛蚩寺〉妮d體. 2. 能夠?qū)⑼庠碊NA導(dǎo)入寄主細(xì)胞. 3. 質(zhì)粒-大腸桿菌是一種成功的基因克隆體系.,,.,.,1977年，E. coli中合成了人生長(zhǎng)激素基因。 1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)。 1982年，培育出了超級(jí)鼠。 1985年Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤(pán)法，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。 1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。 1990年，Perlak 將B.T.基因?qū)朊藁ǐ@得抗蟲(chóng)棉 。 1991年，美國(guó)開(kāi)始人類(lèi)基因組計(jì)劃。 1997年，“多利”綿羊誕生。,（4） 發(fā)展過(guò)程中的重大事件,.,.,轉(zhuǎn)移大鼠生長(zhǎng)素基因的小鼠,.,.,.,.,1.2 基因工程研究?jī)?nèi)容,目的基因分離 制備重組DNA分子 重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞 篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆 提取已擴(kuò)增的目的基因 目的基因克隆到表達(dá)載體上，表達(dá)，產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物,.,.,.,.,第一次課結(jié)束,.,.,瓊脂糖凝膠電泳(0.2-50kb DNA)聚丙烯酰胺凝膠電泳(1-1000bp DNA),1.3 基因操作的基本技術(shù),（1）凝膠電泳：一種分子放置在電場(chǎng)中,會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。,凝膠的分辨能力: 凝膠的類(lèi)型和凝膠的濃度有關(guān) 凝膠電泳的作用: 分析,制備和純化 溴化乙錠:簡(jiǎn)稱(chēng)EB.,,.,.,,,.,.,EB的工作原理：,溴化乙啶,.,.,,-,+,電泳方向,EB分辨率：,0.05μg/帶,.,.,原理:帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合，互補(bǔ)區(qū)段會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。,（2）核酸的分子雜交 1968年華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院 Roy Britten等,常見(jiàn)的分子雜交：,.,.,Southern Blotting雜交:,——1975年，英國(guó)人Southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。,.,.,Southern印跡雜交顯色圖片,用途：確定DNA 大小，鑒定DNA轉(zhuǎn)化結(jié)果。,.,.,Northern Blotting雜交:1979年，J.C.Alwine等，應(yīng)用于特定性狀基因在mRNA水平上的動(dòng)態(tài)表達(dá)研究。。,流程：RNA混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳→分離得到的RNA轉(zhuǎn)膜→與放射性標(biāo)記的探針雜交 →結(jié)果分析,.,.,（3）細(xì)菌的轉(zhuǎn)化（Transformation）,——一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過(guò)程。,.,.,雙脫氧鏈終止法（Sanger法）：英國(guó)生物化學(xué)家Frederick Sanger于1977年發(fā)明,（4）DNA核苷酸序列分析,,,模板 標(biāo)記的引物 DNA聚合酶 dNTP 雙脫氧鏈終止物ddNTP,,反應(yīng)組成,檢測(cè)方法：電泳 放射自顯影讀出DNA序列長(zhǎng)度：250bp,.,.,,.,.,DNA Sequencing via the Sanger Method,模板 標(biāo)記的引物 DNA聚合酶 dNTP 雙脫氧鏈終止物ddNTP,.,.,Frederick Sanger,1918年8月13日－2013年11月19日，英國(guó)生物化學(xué)家。 是第四位兩度獲得諾貝爾獎(jiǎng)，以及唯一獲得兩次化學(xué)獎(jiǎng)的人。,1958年：確定胰島素結(jié)構(gòu)，獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1980年：發(fā)明Sanger測(cè)序法，再諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),.,.,化學(xué)降解法(Maxam-Gilbert法）：250bp 1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert建立的DNA片段序列的測(cè)定方法,.,.,DNA分子末端放射性標(biāo)記,電泳,四個(gè)獨(dú)立的降解體系,放射自顯影,G反應(yīng)：G甲基化（硫酸二甲酯） G+A反應(yīng)：A和G質(zhì)子化（甲酸） T+C反應(yīng)：T和C嘧啶環(huán)斷裂（肼） C反應(yīng)：C嘧啶環(huán)斷裂（高鹽、肼）,,,,,,.,.,DNA序列分析儀,.,.,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR ） 1985年，美國(guó)，Mullis：體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。成果發(fā)表在Science上。,（5）基因擴(kuò)增（gene amplification）,1993年因發(fā)明PCR技術(shù)，與邁克爾·史密斯分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),Kary Banks Mullis，1944年12月28日－,“我感謝諾貝爾評(píng)獎(jiǎng)委員會(huì),在我還能夠盡情享受生活的年齡及時(shí)地把諾貝爾獎(jiǎng)授予給我.”,“Fish don’t know much about water, and people didn’t know much about air.” “Play! Experiment! Discover!”,.,.,.,.,基本原理：,.,.,.,.,.,.,1.4 基因克隆需要特殊的工具和技術(shù),運(yùn)輸工具： 細(xì)菌質(zhì)粒 病毒染色體 DNA操作技術(shù) 純化DNA 剪切DNA分子 分析DNA片段大小連接DNA分子 將DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞重組子的鑒定,,,.,.,1.5 基因工程的意義,大規(guī)模的生產(chǎn)生物分子 設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種 搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息。,.,.,醫(yī)藥 重組藥物 基因治療 檢測(cè)遺傳疾病、病原 農(nóng)業(yè) 抗病蟲(chóng) 提高品質(zhì) 提高花卉的觀賞價(jià)值 抗逆性 家畜：瘦肉比；飼料利用率；加快生長(zhǎng),.,.,主要基因工程產(chǎn)品的研制、開(kāi)發(fā)、上市時(shí)間,.,.,.,,謝謝聆聽(tīng),2018/7/21,53,