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1.2　基因工程的基本操作程序 【導學目標】 1.簡述基因工程原理及基本操作程序。 2.嘗試設計某一轉基因生物的研制過程。 【自主學習】 基因工程的基本操作程序 1. 的獲取。 2． 的構建。 3．將目的基因導入 。 4．目的基因的 與鑒定。 一、目的基因的獲取 1.目的基因：主要是指編碼蛋白質的 ，也可以是一些具有 。 2．基因文庫 (1)基因文庫的含義：將含有某種生物不同基因的許多 ，導入 的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。 (2)基因文庫的種類 ①基因組文庫：含有一種生物的 基因。 ②部分基因文庫：含有一種生物的 基因。 3．獲取目的基因的方法 (1)從基因文庫中獲取目的基因 (2)利用PCR技術擴增目的基因 ①PCR的含義：是一項在生物體外 特定DNA片段的核酸合成技術。 ②過程：目的基因受熱形成 ，與引物結合，在 的作用下延伸形成DNA。 ③方式：指數(shù)擴增＝2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù))。 (3)人工合成法：若 較小， 序列已知，可以人工合成。 二、基因表達載體的構建 1.基因表達載體的組成 2．基因表達載體的功能 (1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以 給下一代。 (2)使目的基因 和發(fā)揮作用。 三、將目的基因導入受體細胞 1.轉化： 進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。 2．導入植物細胞 (1)方法： 、基因槍法、花粉管通道法等。 (2)農桿菌的特點 ①易感染 和裸子植物。 ②Ti質粒上的 可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞 上。 3．導入動物細胞 (1)常用方法： 技術。 (2)常用受體細胞： 。 4．導入微生物細胞 (1)原核生物特點：繁殖快、多為 、遺傳物質相對 等。 (2)對受體細胞的常用處理方法：用 處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細胞稱為 )。 四、目的基因的檢測與鑒定 1.檢測方法 (1) 技術：①檢測轉基因生物的 上的目的基因；②檢測目的基因是否轉錄出 。 (2)抗原—抗體雜交技術：用于檢測目的基因是否翻譯成 。 2．鑒定： 鑒定、抗性鑒定等。 思考交流 1．利用PCR技術擴增目的基因時，需要提供哪些物質和條件？ 2．一般情況下，基因工程操作獲得成功的標志是什么？ 正誤判斷 1．基因工程操作程序中的核心步驟是基因表達載體的構建。( ) 2．利用反轉錄法獲取的目的基因在構建基因表達載體時，可以不另外添加啟動子和終止子。( ) 3．基因表達載體中的啟動子和終止子決定著翻譯的開始與結束。( ) 4．將目的基因導入微生物細胞時，對受體細胞不需做任何處理。( ) 5．DNA分子雜交是在分子水平上進行的目的基因的檢測。( ) 【合作探究】 一、什么是基因文庫、基因組文庫、cDNA文庫？ 請列表比較基因組文庫、cDNA文庫。 文庫類型 cDNA文庫 基因組文庫 概念 文庫大小 小 大 基因中有無啟動子 基因中有無內含子 基因多少 某種生物的部分基因 某種生物的全部基因 物種間的基因交流 可以 二、PCR技術與生物體內DNA復制的比較： 項目 PCR技術 DNA復制 不同點 解旋方式 解旋酶催化 場所 主要在細胞核內 酶 細胞內含有的DNA聚合酶 溫度條件 細胞內溫和條件 結果 形成整個DNA分子 相同點 原理 DNA雙鏈復制(堿基互補配對) 原料 四種游離的脫氧核苷酸 條件 模板、ATP、酶等 三、獲取目的基因的方法有哪些，分別在什么情況下使用？ 1．如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過 的方法。 2．如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過 。 3．如果只知道擴增目的基因的兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，則可以通過 目的基因。 四、構建基因表達載體的目的是什么？ 基因表達載體在組成上至少應包括哪四部分，其各自的作用是什么？ 例1 將ada(腺苷酸脫氨酶基因)通過質粒pET28b導入大腸桿菌并成功表達腺苷酸脫氨酶。下列敘述錯誤的是 A．每個大腸桿菌細胞至少含一個重組質粒 B．每個重組質粒至少含一個限制性核酸內切酶識別位點 C．每個限制性核酸內切酶識別位點至少插入一個ada D．每個插入的ada至少表達一個腺苷酸脫氨酶分子 【答案】　C 五、不同受體細胞的常用導入方法 生物種類 植物細胞 動物細胞 微生物細胞 常用方法 農桿菌轉化法 顯微注射法 Ca2＋處理法 受體細胞 體細胞 受精卵 原核細胞 轉化過程 目的基因插入Ti質粒的T－DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA→表達 目的基因表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子 例2 我國中科院上海生化所合成了一種具有鎮(zhèn)痛作用而又不會像嗎啡那樣使病人上癮的藥物——腦啡肽多糖(類似于人體中的糖蛋白)。在人體細胞中糖蛋白必須經過內質網和高爾基體的進一步加工才能形成。如果要采用基因工程和發(fā)酵工程技術讓微生物來生產腦啡肽多糖，應該用下列哪種微生物作受體細胞 A．大腸桿菌　　　B．酵母菌 C．T4噬菌體 D．大腸桿菌質粒 【答案】　B 六、不同水平上對目的基因檢測與鑒定的方法主要有哪些？ 類型 步驟 檢測內容 方法 結果顯示 分子檢測 導入檢測 目的基因是否導入受體細胞 DNA分子雜交技術： 和 之間 是否成功顯示出雜交帶　 表達檢測 目的基因是否轉錄出mRNA 核酸分子雜交技術： 和 之間 是否成功顯示出雜交帶 目的基因是否翻譯出蛋白質 蛋白質分子雜交： 和 之間 是否成功顯示出雜交帶 個體生物學 水平的鑒定 ①確定是否具有抗性及抗性程度②基因工程產品與天然產品的活性是否相同 ①抗蟲或抗病的接種實驗 ②基因工程產品與天然產品活性的比較 是否賦予了預期抗性或蛋白質活性 【達標檢測】 課堂達標 1．下列不屬于獲取目的基因的方法是(　　) A．利用DNA連接酶復制目的基因 B．反轉錄法 C．從基因文庫中獲取目的基因 D．利用PCR技術擴增目的基因 2．下列關于基因表達載體構建的相關敘述，不正確的是(　　) A．需要限制酶和DNA連接酶 B．必須在細胞內進行 C．抗生素抗性基因可作為標記基因 D．啟動子位于目的基因的首端 3．目前，將目的基因導入動物細胞最常用和最有效的方法是(　　) A．顯微注射法　　　B．農桿菌轉化法 C．基因槍法 D．花粉管通道法 4．在用基因工程技術構建抗除草劑的轉基因煙草過程中，下列操作錯誤的是(　　) A．用限制性核酸內切酶切割煙草花葉病毒的核酸 B．用DNA連接酶連接經切割的抗除草劑基因和載體 C．將重組DNA分子導入煙草原生質體 D．用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉基因煙草細胞 5．利用蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因培育的抗蟲棉是否成功，最好檢測(　　) A．是否有抗生素產生 B．是否有目的基因表達 C．是否有抗蟲的性狀出現(xiàn) D．是否能分離到目的基因 6. 科學家通過基因工程方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內，并成功實現(xiàn)了表達，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株——抗蟲棉。其過程大致如下圖所示。根據(jù)題意，回答下列問題。 (1)基因工程的操作程序主要包括的四個步驟是：________________、________________、________________、________________。 (2)Ti質粒是農桿菌中的一種質粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti質粒的T－DNA中是利用T－DNA____________________________的特點。 (3)Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內并成功實現(xiàn)表達的過程，在基因工程中稱為________。 (4)將目的基因導入受體細胞的方法有很多種，該題中涉及的是________________。 (5)目的基因能否在棉株體內穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性的關鍵是___________________________________， 這需要通過檢測才能知道，檢測采用的方法是_______________________________________________。 課外強化 1．農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下圖為農桿菌轉化法的示意圖，試回答下列問題。 (1)一般情況下農桿菌不能感染的植物是________，利用農桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現(xiàn)__________________。具體原理是在農桿菌的Ti質粒上存在T－DNA片段，它具有可轉移到受體細胞并整合到受體細胞的________上的特點，因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入到________(部位)即可。 (2)根據(jù)T－DNA這一轉移特點，猜測該DNA片段上可能含有控制________________(酶)合成的基因。 (3)圖中過程c中，能促進農桿菌移向植物細胞的物質是________類化合物。 (4)植物基因工程中將目的基因導入受體細胞的方法除了農桿菌轉化法之外，還可采取的方法是 。(至少寫出兩種)