《四川農(nóng)業(yè)大學本科畢業(yè)論文答辯用幻燈片PPT演示課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《四川農(nóng)業(yè)大學本科畢業(yè)論文答辯用幻燈片PPT演示課件（16頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因的克隆及其序列分析,,.,目的,目 錄,1,材料與方法,2,結(jié)果,3,結(jié)論,4,參考文獻,5,致謝,6,.,1 目的,促性腺素受體（GtH-RⅡ）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，其與促性腺激素（GtHⅡ）結(jié)合后可促進卵母細胞的成熟以及在精子發(fā)生的最后幾個時期起主要作用。 魚類中GtHⅡ基因除了在性腺中有豐富的表達外，在非性腺組織中也有少量或微量表達；可是還沒有人對齊口裂腹魚垂體組織中GtH-RⅡ基因進行克隆及序列分析，因此通過完成本次試驗，為進一步研究齊口裂腹魚的繁殖調(diào)控機制提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。,.,2 材料與方法,2.1 試驗材料 　　齊口裂腹魚平均體長為30-40cm； 平均體重為0.5-1.0kg。采集齊口裂腹魚垂體組織樣品，置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩? 2.2 引物設計與合成 根據(jù)NCBI上斑馬魚GtH-RⅡ的cDNA序列，選取保守區(qū)序列；上游引物為5′CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3′，下游引物為5′ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3′，委托華大基因科技有限公司進行特異性引物合成。,.,2.3 方法,,,,,,,,,,,,,引物設計與合成,反轉(zhuǎn)錄反應,PCR擴增,PCR產(chǎn)物回收,克隆測序,,序列分析,總RNA提取,,,.,3 結(jié)果,圖1 齊口裂腹魚垂體組織總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖,圖2 齊口裂腹魚GtH-R Ⅱ基因PCR電泳檢測圖,3.1 總RNA提取結(jié)果,3.2 RT-PCR產(chǎn)物檢測,.,3.3 GtH-RⅡ核酸序列比對,圖3 齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因cDNA部分編碼核酸序列分析,齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚,GtH-RⅡ基因編碼核酸的測序結(jié)果與Genbank上斑馬魚序列進行相似性分析，相似性達93.0%，與鯉魚的相似性為92.6%。,.,3.4 氨基酸相似性分析,GtH-RⅡ基因編碼氨基酸序列的測序結(jié)果與Genbank上斑馬魚的序列進行相似性分析，相似性達97%以上。,,圖4 齊口裂腹魚GtH-RⅡ氨基酸序列及序列分析,,,,,,,,,,,,,,,,,,.,3.5 GtH-RⅡ氨基酸組成分析,亮氨酸（Leu）含量為最高，達到了16.45%，賴氨酸（Lys）含量最低，只有0.87%；其它具體的氨基酸組成類型及酸值見表1。,表1 齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因編碼的氨基酸組成,圖5 齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因編碼的氨基酸組成,,,.,3.6 GtH-RⅡ的氨基酸疏水性分析與抗原決定簇預測,GtH-R Ⅱ基因編碼的氨基酸疏水性中存在4個疏水區(qū)，分別位于第57、90、132和186氨基酸殘基附近;而氨基酸序列中則存在4個抗原決定簇，分別位于第27、34、112和159氨基酸殘基附近。,圖6 齊口裂腹魚GtH-RⅡ氨基酸的平均疏水性比例,圖7 齊口裂腹魚GtH-RⅡ蛋白抗原決定簇預測,,,,,,,,,.,3.7 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測,圖8 齊口裂腹魚GtH-RⅡ蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測 h表示α螺旋；e表示β折疊；c表示無規(guī)則卷曲,,β折疊占15.24%,α螺旋占61.43%,無規(guī)則卷曲占23.33%,,,.,3.8 蛋白質(zhì)磷酸化位點分析,由上圖可知，GtH-RⅡ蛋白中含有4個磷酸化位點，全是Ser（Serine絲氨酸）位點有4個，沒有Thr（threonine蘇氨酸）、Tyr（tyrosine酪氨酸）。,圖9 齊口裂腹魚LHR蛋白磷酸化位點預測,,,,.,4 結(jié)論,此次試驗得到的結(jié)果顯示：獲得的齊口腹裂魚GtH-RⅡ基因的長度為696 bp；與斑馬魚的序列相似性較高，表明同源性較近，其基因具有較高的保守性。 　　　對氨基酸和蛋白質(zhì)分析顯示：α螺旋占的比例大，存在4個抗原決定簇和4個疏水區(qū)；說明GtH-RⅡ蛋白柔性好，是油溶性受體蛋白的可能性強。 　　 最后得出齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因的保守性高，同時也為進一步研究齊口裂腹魚的繁殖調(diào)控機制提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而具體的調(diào)控機制則有待進一步的研究。,.,5 參考文獻,[1] Kraak GVD, Suzuki K, Peter RE, et al. ProPerties of common carp gonadotroPin I and gonadotroPin Ⅱ[J]. General and ComParative Endocrinology 1992, 85(2): 217-229 [2] Oba Y, Hirai T, Yoshiura Y, et al. The duality of fish gonadotropin receptor：Cloning，functional characterization of a second gonaotropin receptor cDNA expressed in the ovary and testis of amago salmon (oncorhynchus rhodurus)[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 265(2):366-371. [3] Oba Y, Hirai T, Yoshiura Y, et al. Cloning, functional charac-terization, and expression of a gonadotropin receptor cDNA in the ovary and testis of amago salmon(Oncorhynchus rhodurus)[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999,263(2): 584-590. [4] Kumar R S, Ijiri S, Trant J M. Molecular biology of the channel catfish gonadotropin receptors:1. Cloning of a functional luteinizing hormone receptor and preovulatory induction of gene expression[J]. Biol Reprod, 2001,64(3):1010-1018. [5] Kumar R S, Ijiri S, Trant J M. Molecular biology of the channel catfish gonadotropin receptors: 2. Complementary DNA cloning,functional expression,and seasonal gene expression of the follicle-stimulating hormone receptor[J]. Biol Reprod, 2001,65(3):710-717. [6] Swanson P, Dittman A. Pituitary gonadotropins and their receptors in fish[C] // Advances in Comparative Endocrinology.Italy:Bologna,1997. 841-856. [7] Vischer H F, Bogerd J. Cloning and functional characterization of a gonadal luteinizing hormone receptor complementary DNA from the African catfish (Clarias gariepinus)[J]. Biol Reprod, 2003, 68(1): 262-271. [8] Bojerd J, Blomenrohr M, Andersson E, et al. Discrepancy between molecular structure and ligand selectivity of a testicular follicle-stimulating hormone receptor of the African catfish (Clarias garie Pinus)[J]. Biol Reprod, 2001, 64(6): 1633-1643. [9] Rocha A, Gómez A, Zanuy S, et al. Molecular characterization of two sea bass gonadotropin receptors:cDNA cloning, expression a-nalysis, and functional activity [J]. Molecular and Cellular Endo-crinology, 2007, 272(1-2): 63-76. [10] Mittelholzer C, Andersson E, Taranger G L, et al. Molecular characterization and quantifcation of the gonadotropin receptors FSH-R and LH-R from Atlantic cod(Gadus morhua)[J]. Gener-al and Comparative Endocrinology, 2009, 160(1): 47-58. [11] Schulz R W, Vischer H F, Cavaco J E B, et al. Gonadotropins, their receptors, and the regulation of testicular functions in fish [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 2001, 129(2): 407-417. [12] Ascoli M, Fanelli F, Segaloff D L. The lutropin/choriogonado-tropin receptor, a 2002 perspective [J]. Endocr Rev, 2002, 23(2):141-174. [13] Themmen A P N, Huhtaniemi I T. Mutations of gonadotropins and gonadotropin receptors: elucidating the physiology and patho-physiology of pituitary-gonadal function [J]. Endocr Rev, 2000,21(5): 551-583. [14] Vassart G, Pardo L, Costagliola S. A molecular dissection of the glycoprotein hormone receptors [J]. Trends Biochem Sci, 2004,29(3): 119-126. [15] 劉瓊,李建中,周毅,等.魚類促性腺激素受體研究進展[J].生命科學研究，2010，14（3）：263-267. [16] Maugars G, Schmitz M. Molecular cloning and characterization of FSH and LH receptors in Atlantic salmon(Salmo salar L.)[J]. General and Comparative Endocrinology, 2006, 149(1): 108-117.,.,6 致謝,值此論文完成之際，忠心感謝導師姜冬梅老師給予的悉心指導和殷切教誨。導師為本課題的順利完成付出了大量心血。在此論文完成之際，謹向姜冬梅老師及其愛人康波老師致以最深的敬意和最衷心的感謝！ 在此，我還要感謝一起度過大學生活的室友羅學奎、江前有、楊高以及10級水產(chǎn)系的同學們和12教101室的碩士研究生師兄們；同時也要感謝四川農(nóng)業(yè)大學動物類實驗教學示范中心為完成此次試驗所提供的儀器設備。正是有了你們的幫助和支持，我才能克服眾多困難，順利完成論文的寫作。 最后尤其要感謝的是我的家人，漫漫求學路，是父母親人的一路支持和鼓勵，敦促我不斷的前進！ 在此謹向幫助過我的所有朋友，致以最衷心的謝意！,.,,謝謝大家,.,