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單克隆抗體知識,1,抗體是具有4條多肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)，其中2條較長、相對分子量較大的相同的重鏈（H鏈）；2條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈（L鏈）。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯(lián)結(jié)形成一個由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子。輕鏈有κ和λ兩種，重鏈有μ、δ、γ、ε和α五種。 整個抗體分子可分為恒定區(qū)和可變區(qū)兩部分。在給定的物種中，不同抗體分子的恒定區(qū)都具有相同的或幾乎相同的氨基酸序列?？勺儏^(qū)位于“Y”的兩臂末端。在可變區(qū)內(nèi)有一小部分氨基酸殘基變化特別強烈，這些氨基酸的殘基組成和排列順序更易發(fā)生變異區(qū)域稱高變區(qū)。高變區(qū)位于分子表面，最多由17個氨基酸殘基構(gòu)成，少則只有2 ～ 3個。高變區(qū)氨基酸序列決定了該抗體結(jié)合抗原抗原的特異性。 一個抗體分子上的兩個抗原結(jié)合部位是相同的，位于兩臂末端稱抗原結(jié)合片段（antigen-binding fragment, Fab）。“Y“的柄部稱結(jié)晶片段（crystalline fragment,FC），糖結(jié)合在FC 上。,抗體是指能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的具有免疫活性的球蛋白,抗體的基本知識,2,抗體結(jié)構(gòu)圖,抗體是指能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的具有免疫活性的球蛋白,抗體的作用機制：抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)及補體依賴性細(xì)胞溶解作用,3,單克隆抗體的制備方式： 1 傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法 2基因工程單克隆抗體制備方法 3未來單克隆抗體的發(fā)展方向,4,傳統(tǒng)的單抗制備方法,5,單克隆抗體在理論和實踐上的應(yīng)用成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的重要手段。但是，上述應(yīng)用的單抗屬于鼠源性，鼠源性單抗應(yīng)用于人類的臨床應(yīng)用結(jié)果反映出了單克隆抗體藥物存在的一些問題 :(1) 鼠源性單抗容易容易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA) ,在體內(nèi)作為異源蛋白被清除掉，從而削弱其治療的有效性 。(2) 鼠源性單抗在人體內(nèi)生物活性降低，不能有效地激活人體的生物效應(yīng)。,研究背景,因此，人們一直致力于人源性抗體的研究。,6,人源化治療性單克隆抗體的研究進展,構(gòu)建的基本思路,鼠抗體人源化就是通過基因改造，使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，避免誘導(dǎo)HAMA（人抗鼠抗體）反應(yīng)。遵守兩個原則首先，要保持抗體的親和力和特異性；其次，要降低或消除抗體的免疫原性。,7,以分子生物學(xué)技術(shù)提取、擴增編碼人抗體的DNA，構(gòu)建質(zhì)粒，建立組合抗體文庫，再利用供者文庫建立針對某一特定抗原的子文庫。以該技術(shù)制備的抗體片段(Fab)是人源抗體，具有建庫簡單、抗體表達穩(wěn)定等特點。迄今已有多種抗體產(chǎn)生?？梢灶A(yù)見，該技術(shù)具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。,解決方案：,（1）用人脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交；,（2）用EB病毒轉(zhuǎn)化人的B淋巴細(xì)胞；,（3）用基因工程法制備嵌合抗體等。,,效果不強,（4）最新方法：——抗體庫篩選技術(shù)和轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù),8,單克隆抗體的發(fā)展史,第一代：鼠源性單抗,藥物特異性很強，副作用大，現(xiàn)在已經(jīng)漸漸退出市場。不過由于其代謝比較快，目前在放射性元素標(biāo)記的單克隆抗體藥物中使用。,第二代：人鼠嵌合性單抗,進行人源化改造，使其人源化程度達到70%左右。,第三代：CDR移植抗體和SDR移植抗體,人源化程度達到95%左右，大大降低了毒副作用。,第四代：全人源化單抗,2002年，的世界首個藥物——阿達木單抗上市。人源化及全人源單克隆抗體由于副作用小，在體內(nèi)停留時間長，更有利于治療。,9,鼠源性單克隆抗體：鼠雜交瘤單克隆抗體主要是將來源于免疫接種過的小鼠的B 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，繼而篩選出既能無限增殖又能分泌抗體的鼠雜交融合細(xì)胞，進而進行篩選、抗體制備和抗體純化。 嵌合性單克隆抗體：指用人的恒定區(qū)取代小鼠的恒定區(qū)，保留鼠單抗的可變區(qū)序列，形成一個人-鼠雜合的抗體。其研制程序快，可大幅度降低異源抗體的免疫原性，卻幾乎保持親本鼠單抗全部的特異性和親和力。另外，它還具有人抗體的效應(yīng)功能，如補體固定、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等。 人源化單克隆抗體：利用現(xiàn)有的無數(shù)已詳細(xì)分析過的小鼠抗體，取其與抗原直接接觸的那段抗體片段（互補決定區(qū)，CDR）與人的抗體框架嫁接，經(jīng)親和力重塑，可維持其特異性和大部分的親和力，同時幾乎去除免疫原性和毒副作用。 全人源單克隆抗體：其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗體制備的相關(guān)技術(shù)主要有：人雜交瘤技術(shù)、EBV 轉(zhuǎn)化 B 淋巴細(xì)胞技術(shù)、噬菌體顯示技術(shù)（phage display）、轉(zhuǎn)基因小鼠抗體制備技術(shù)（transgenic mouse）和單個B細(xì)胞抗體制備技術(shù)等。,10,11,1.嵌合抗體（Chimeric antibody),用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)，即該單抗由鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)組成的嵌合抗體。,由于嵌合抗體可變區(qū)（V）約占整個抗體的30%，鼠源性抗體V區(qū)中的框架區(qū)（FR)仍殘留一定的免疫原性，可誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)。,靈長目源抗體也是一類嵌合抗體，通過免疫短尾猿猴產(chǎn)生。由于其抗體的可變區(qū)與人可變區(qū)無差異，不至于發(fā)生抗體反應(yīng)。,缺點,解決方案,鼠源抗體,嵌合抗體,,12,2.CDR移植抗體（CDR grafted antibody),真正意義上的抗體人源化?？贵w中除了3個互補決定區(qū)（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，人源化程度可達到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。,不足,有時異基因的CDR人源化抗體可能引起抗個體基因型反應(yīng)。,改良方案,——進行SDR移植改良,,嵌合抗體,人源化抗體,3個CDR,13,3.SDR移植抗體(SDR grafted antibody),在CDR移植抗體的基礎(chǔ)上，將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體相應(yīng)位置上，進一步降低了抗體的異源性。通過這種方法，使人源化的抗體潛在的免疫原性降至最低。,14,4.全人單克隆抗體（Fully humaneantibody),它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性。,4.1.抗體庫篩選技術(shù),4.1.1.噬菌體表面展示技術(shù),鼠源抗體,完全人源化抗體,,15,,基本原理和程序,噬菌體抗體庫,人免疫細(xì)胞基因組,,PCR技術(shù)擴增,整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因,,噬菌體DNA中有抗體基因 外殼表面有抗體分子的表達,克隆并以融合蛋白的形式表達,基因重組,噬菌體重組DNA,,,構(gòu)建,,利用抗原-抗體特異性,篩選所需抗體并進行克隆擴增,,獲得可溶性抗體片段,表達,16,2018/9/24,局限性,1.在噬菌體展示過程中涉及細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝、展示跨膜分泌，這就大大限制了所建庫的容量和分子的多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫容量在109。2.不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時需要外加選擇壓力。3.噬菌體展示文庫無法進行有效的體外突變和重組進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。4.因為噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達，所以一些對細(xì)胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很難得到有效表達和展示。,17,4.1.2.核糖體展示技術(shù),基本原理和程序,人免疫細(xì)胞基因組,EDTA,,體外轉(zhuǎn)錄、翻譯、偶聯(lián),mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體,,核糖體展示的蛋白文庫,構(gòu)建,基因型和表型聯(lián)系,,利用抗原-抗體特異性,篩選所需抗體復(fù)合體,,EDTA解離,獲得特異mRNA,,RT- PCR,RT- PCR,特異抗體DNA子文庫,獲得特異性的、高親和力的抗體,,表達,18,2018/9/24,傳統(tǒng)的篩選技術(shù)具有本身難以克服的缺陷，主要表現(xiàn)在構(gòu)建文庫和篩選時都涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)染、噬菌體包裝、跨膜分泌和蛋白質(zhì)降解等諸多方面的問題，文庫容量及其分子多樣性在某種程度上受到很大的限制，降低了文庫篩選效率。核糖體展示技術(shù)由于在體外無細(xì)胞翻譯體系中進行，用mRNA的可復(fù)制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的限制。它大大的提高了文庫容量和篩選通量（1012-1014）而且能夠增加表達的蛋白質(zhì)的溶解度。,優(yōu)勢,19,4.2.轉(zhuǎn)基因小鼠,通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因失活，并導(dǎo)入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體重輕基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種人抗體基因小鼠所攜帶的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地進行同型轉(zhuǎn)換和親和力成熟。任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠，使其產(chǎn)生高親和力的人抗體。,案例：,日本麒麟公司用基因工程技術(shù)，使小鼠攜帶完整的人14號染色體，該染色體包含全部人抗體產(chǎn)生基因。,但迄今尚無該技術(shù)生產(chǎn)的制品問世。,20,4.3.微胞雜交干細(xì)胞技術(shù),——日本學(xué)者Ishida等首先提出,技術(shù)要點： 首先將抗G418的人成纖維細(xì)胞與小鼠的A9細(xì)胞融合，通過篩選，得到抗G418的小鼠A9細(xì)胞，再運用PCR或原位熒光雜交方法篩選，先篩選出的細(xì)胞用秋水仙素處理48h，然后用細(xì)胞松弛素B處理并高速離心，分離出含2號、14號、22號染色體的小鼠。,人源抗體在這種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)量還比較低。,21,4.4.其他方法,XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨髓移植的方法，用放射線破壞動物骨髓，然后注入人抗體生成細(xì)胞。該公司已用此法生產(chǎn)出一種全人單抗。,22,2018/9/24,近年來 ,人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床應(yīng)用帶來了新的希望 ,當(dāng)前正處于臨床研究的多種抗體中 , 嵌合抗體和 人 源 化 抗 體 所 占 比 例 大 于70 %。目前的人源化抗體 ,主要用于腫瘤、 自身免疫性疾病和心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應(yīng)和抗病毒感染等方面。,人源化抗體的臨床應(yīng)用,23,1 .在腫瘤治療方面的應(yīng)用:單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應(yīng)。如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥——重組人 源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體(商品名：泰欣生)。泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30%以上。 2 .在器官移植中的應(yīng)用: 近年來 ,利用抗體藥物作為實體器官移植的誘導(dǎo)治療逐漸增加。如1986年批準(zhǔn)進入美國市場的治療性抗體類藥物抗 CD3單抗即被用于腎、 心臟、 肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。 3 .在心血管疾病方面的應(yīng)用：美國 FDA 于 1994 年批準(zhǔn)了第一個人-鼠嵌合 Fab 抗體的上市，該抗體現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多種心血管疾病治療 ,主要用于預(yù)防冠狀動脈成形術(shù)后的再狹窄。,2018/9/24,24,4 .在自身免疫性疾病方面的應(yīng)用:現(xiàn)有的研究表明 ,抗體對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 牛皮癬、 多發(fā)性硬化、 硬皮病、 潰瘍性結(jié)腸炎等療效較好。 5 . 在抗病毒感染方面的應(yīng)用：近年來研究表明 ,在 HBV、HCV、 HIV 等病毒感染性疾病中 ,人源化抗體顯示了較好的應(yīng)用前景。如：商品名為 SynagisTM的抗呼吸道病毒感染的抗體在美國已經(jīng)上市 ,為人源化的基因工程抗體。,2018/9/24,25,目前上市的單抗情況,26,未來抗體的發(fā)展方向,27,謝謝,28,