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乙肝病毒的檢測 1 HBV的三種形態(tài) 1 HepatitisBvirion Daneparticle 2 secretedfilament3 secretedsphere 6 2 乙型肝炎病毒HBV HBV是嗜肝脫氧核糖核酸病毒科的哺乳動(dòng)物屬的一員 HBV陽性的血清中有三種病毒顆粒 大球形顆粒 完整的HBV顆粒直徑為42nm 又名Dane顆粒 分為包膜與核心的兩部分 外衣殼及包膜含有表面抗原 衣殼內(nèi)為核心結(jié)構(gòu) 有核心抗原 核心抗原下面藏有e抗原 3 小球形顆粒 陽性血清中最多的顆粒 主要為表面抗原 不含核酸及 成分 為不完整的 管形顆粒 實(shí)際上是一串小球形顆粒聚合在一起的 也含有表面抗原 4 5 HBV感染的實(shí)驗(yàn)室檢查 5 1 乙型肝炎的生物化學(xué)檢測 主要指標(biāo) ALT AST ASTm 血清白蛋白 血清膽紅素 膽堿酯酶 甲胎蛋白 凝血酶原時(shí)間 PT 及部分凝血因子 6 6 方法學(xué)ELISA 靈敏性高 成本低 適用于普通病人篩查 膠體金免疫層析法 金標(biāo)法 簡便易行 可用于急診病人快速檢測 化學(xué)發(fā)光法定量檢測 價(jià)格昂貴 可用于HBVMs為臨界值的病人的確證 可間接反映宿主HBV的復(fù)制水平 在評(píng)價(jià)抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答 療效和判斷預(yù)后方面有重要意義 新增檢測指標(biāo)Pre S1 Pre S2及其相應(yīng)抗體對(duì)乙肝兩對(duì)半認(rèn)識(shí) 7 2 HBV血清標(biāo)志物檢測 7 8 Pre S1檢測的臨床價(jià)值 前S1蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上 在HBV感染宿主細(xì)胞過程及在病毒復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中起重要作用 前S1抗原與HBeAg之間有高度相關(guān)性 并可區(qū)別因變異種及其他原因造成的乙肝病毒e抗原 HBeAg 假陰性 可作為HBeAg假陰性補(bǔ)充 從而準(zhǔn)確反映患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況 可作為HBV感染及復(fù)制的標(biāo)注 與其它血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測 相互補(bǔ)充 Back 8 乙型肝炎的兩對(duì)半1 乙肝病毒表面抗原 HBsAg 和表面抗體 HBsAb 2 e抗原 HBeAg 和e抗體 HBeAb 3 核心抗原 HBcAg 和核心抗體 HBcAb 這三對(duì)乙肝病毒的抗原和抗體 由于HBcAg主要存在于受感染的肝細(xì)胞及乙肝病毒顆粒的核心內(nèi) 一般血清中較難檢測到 只有用特殊的方法處理后才能查到 所以通常只能檢測到HBcAb 也就是說這第三對(duì)通常只能檢測到半對(duì) 所以稱之為 兩對(duì)半 兩對(duì)半 是乙肝病毒最常用的血清學(xué)標(biāo)記 9 乙肝五項(xiàng)的32種組合 10 11 12 13 大三陽 小三陽 vs 13 14 HBVDNA定量檢測病毒復(fù)制水平最可靠 最直接的證據(jù) 與傳染性和疾病進(jìn)展密切相關(guān) 主要用于HBV感染的判斷 治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷 HBV基因分型基因分型的必要性 基因分型的主要方法 HBV耐藥突變的檢測 3 HBV分子生物學(xué)診斷 14 病毒基因突變 疾病進(jìn)展 臨床表現(xiàn) 對(duì)干擾素應(yīng)答 耐藥變異 生化學(xué)改善 HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換 HBVDNA清除 急性乙型肝炎 慢性乙型肝炎 肝硬化 LC 肝細(xì)胞癌 HCC 15 HBV基因型 基因亞型 15 常用HBV基因分型方法比較 16 16 客觀看待乙肝DNA 1 乙肝病毒DNA定量往往被描述成為判斷乙肝傳染性大小 病情嚴(yán)重程度以及治療效果的 金指標(biāo) 其實(shí)這些認(rèn)識(shí)都是片面的 乙肝病毒DNA定量檢測為了解乙肝病毒在體內(nèi)的變化增添了新的手段 彌補(bǔ)了以往乙肝病毒 兩對(duì)半 檢測的不足 只要抽血化驗(yàn)檢測乙肝病毒DNA呈陽性 無論其他乙肝病毒檢測結(jié)果如何 都說明患者體內(nèi)存在復(fù)制狀態(tài)的乙肝病毒 血液具有一定傳染性 這對(duì)于評(píng)估治療效果和了解病情變化有一定幫助 但是目前乙肝病毒DNA檢測尚處于研究階段 并非完美無缺 17 乙肝病毒DNA定量不能說明病情輕重乙肝病毒DNA定量數(shù)值只能說明游離在血液中病毒的含量 病毒多少 含量高低與病情嚴(yán)重程度沒有直接關(guān)系 乙肝病情嚴(yán)重程度必須通過檢測肝功系列指標(biāo)確定 這些指標(biāo)包括 轉(zhuǎn)氨酶 膽堿酯酶 膽紅素 白蛋白 凝血酶原活動(dòng)度 轉(zhuǎn)肽酶 蛋白電泳等等 凝血酶原活動(dòng)度 白蛋白 膽堿酯酶數(shù)值越低 說明病情越嚴(yán)重 病毒定量數(shù)值高低與病情無直接關(guān)系 相反 絕大多數(shù)無癥狀乙肝病毒攜帶者 尤其是少年兒童患者 乙肝病毒DNA檢測都為陽性 乙肝病毒處于高復(fù)制狀態(tài) 而他們的病情十分輕微 肝穿結(jié)果顯示 他們的肝組織僅為輕度的非特異性炎癥改變 而大多數(shù)肝硬化或肝癌患者的乙肝病毒DNA檢測多為陰性 而病情卻十分嚴(yán)重 乙肝病毒本身不引起肝細(xì)胞病變 感染的肝細(xì)胞仍然是長壽的 半衰期6 12個(gè)月或更長 乙肝病情輕重決于很多因素 例如患者的免疫狀態(tài) 遺傳因素 病毒的變異等 病毒數(shù)量多少不是病情演變的決定因素 18 4 HBV臨床藥物治療監(jiān)測 乙肝病毒的耐藥性檢測 是精準(zhǔn)治療乙肝的關(guān)鍵 目前由于治療不夠規(guī)范 造成我國目前超過95 的乙肝患者發(fā)生耐藥 病毒變異 病毒耐藥 變異檢測勢在必行 19 19 乙肝五項(xiàng)檢測的影響因素 1 樣本采集與處理的影響1 1標(biāo)本嚴(yán)溶血及混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈 殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性 催化底物顯色造成假陽性 嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用 1 2塑料試管能吸附抗原物質(zhì) 樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性 最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管 并使用非抗凝標(biāo)本 肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值 可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān) EDTA 酶抑制劑 如NaN3 可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性 1 3標(biāo)本凝固不全 正常血液采集后1 2 2h開始凝固 18 24h血塊完全收縮 在工作中 有時(shí)為了爭取時(shí)間快速檢測 常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清 使血清中仍殘留部分纖維蛋白原 在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊 易造成假陽性結(jié)果 因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清 或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?20 2 試劑的影響2 1乙肝兩對(duì)半試劑廠家較多 不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別 有資料顯示 不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89 4 99 3 78 89 存在較大差異 有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差大于15 標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差 使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性 因此 選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一 2 2不同方法學(xué)的檢測試劑 會(huì)使兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)一些不同 例如 在實(shí)際工作中常用ELISA檢測HBsAg結(jié)果為陰性 而電化學(xué)發(fā)光檢測為陽性 除方法學(xué)的靈敏度外 還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別 單抗對(duì)變異抗原或亞型乙肝標(biāo)志物檢測存在差異 建議試劑廠家對(duì)劑的制備應(yīng)該考慮亞型及型濃度的問題 21 3 操作技術(shù)的影響3 1加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性 直接影響檢測結(jié)果 由于吸嘴構(gòu)造特殊 導(dǎo)致清洗困難 加大了交叉污染的機(jī)會(huì) 建議用一次性吸嘴 加樣器也要經(jīng)常清洗 定期校準(zhǔn) 3 2溫浴影響 96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別 易產(chǎn)生邊緣效應(yīng) 抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求 酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同 造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異 干浴與水浴存在明顯的差異 盡可能使用水浴 并要求固相板放入水中 減少受熱不均 貼密封膜 防止污物浸入 3 3冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié) 手冼條件一致性較差 對(duì)結(jié)果影響較大 半自動(dòng)與全自動(dòng)冼板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果 血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài) 造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底 導(dǎo)致 花板 造成假陽性或假陰性 所以操作洗板機(jī)過程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況 及時(shí)糾正 洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清冼幾遍 3 4肉眼判斷結(jié)果時(shí) 顯色淺不易觀察 影響結(jié)果的準(zhǔn)確性 必須使用酶標(biāo)儀檢測 以保結(jié)果一致性 22 4 HooK效應(yīng)影響鉤狀效應(yīng)即HOOK效應(yīng) 是指由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象 其中抗體過量叫做前帶效應(yīng) 抗原過量叫做后帶效應(yīng) 隨著ELISA一步法的應(yīng)用 一些標(biāo)本中抗原含量過高 產(chǎn)生HooK效應(yīng) 影響檢測結(jié)果 采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對(duì)半定量法可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生 23 5 干擾物質(zhì)的影響有人認(rèn)為大約40 的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì) 可以不同程度影響檢測結(jié)果 常見的干擾物質(zhì)有 類風(fēng)濕因子 補(bǔ)體 嗜異性抗體 嗜靶抗原自身抗體 醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體 交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等 如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性 補(bǔ)體從C1q活化 使一抗和酶標(biāo)二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu) Fc的C1q分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來 則補(bǔ)體C1q可將二者連接起來造成假陽性 采用56 30分鐘滅活補(bǔ)體可降低假陽性率 高濃度的AFP 如孕婦 在儲(chǔ)存過程中可能形成二聚體會(huì)導(dǎo)致本底過深影響檢測結(jié)果 24 6 藥物的影響6 1 高效價(jià)的乙肝免疫球蛋白會(huì)與HBsAg形成復(fù)合物 影響HBsAg的檢出 所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后 HBsAg檢測會(huì)呈陰性反應(yīng) 導(dǎo)致乙肝兩對(duì)半少見模式的出現(xiàn) 如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦 為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時(shí) 在孕第8 9 10月常規(guī)注射乙肝免疫球蛋白 不僅影響孕婦HBsAg的檢出 而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性 HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式 可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物 則新生兒HBsAg檢測呈陰性 用0 5M的鹽酸處理標(biāo)本1小時(shí)可提高出率 6 2 為預(yù)防乙肝 部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1 2周內(nèi) 血清中可檢出HBsAg成份 形成一過性HBsAg陽性 這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg 有方法能夠把它檢出 如電化學(xué)發(fā)光法 建議接種乙肝疫苗后1個(gè)月內(nèi)不應(yīng)作HBsAg檢測 25 謝謝 26