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基因工程的基本操作程序 基因操作的基本步驟 基因工程基本操作的四個步驟 1 目的基因的獲取 2 基因表達載體的構(gòu)建 3 將目的基因?qū)胧荏w細胞 4 目的基因的檢測與鑒定 基因操作的基本步驟 一 目的基因的獲取 目的基因主要是 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 獲取目的基因的常用方法有哪些 1 從基因文庫中獲取 2 利用PCR技術(shù)擴增 3 人工合成 1 從基因文庫中獲取目的基因 1 基因文庫的概念 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷 導(dǎo)入到受體菌的群體中 各個受體菌分別含有這種生物的不同基因 2 基因文庫的種類 基因組文庫 含有一種生物的全部基因 部分基因文庫 只包含了一種生物的部分基因 如 cDNA文庫 基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系 3 基因組DNA文庫與cDNA文庫 某生物體內(nèi)全部DNA 許多DNA片段 受體菌群體 與運載體連接導(dǎo)入 基因組文庫 cDNA 受體菌群體 與運載體連接導(dǎo)入 cDNA文庫 某種生物某個時期的mRNA 基因組文庫和部分基因組文庫 cDNA文庫 比較 怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢 依據(jù) 目的基因的有關(guān)信息 如 根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性 4 從基因文庫中得到目的基因的方法 1 構(gòu)建基因組DNA文庫時 首先應(yīng)分離細胞的A 染色體DNAB 線粒體DNAC 總mRNAD tRNA 2 目的基因可從基因文庫中獲得 下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是A 某生物的全套基因就是一個基因文庫B 將含有某種生物不同的許多DNA片段 導(dǎo)入某個生物體內(nèi) 則這個生物就是一個基因文庫C 含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D 含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫 A C 2 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 PCR 聚合酶鏈式反應(yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù) 通過此技術(shù) 可獲取大量的目的基因 以 方式擴增 即 n為擴增循環(huán)的次數(shù) 指數(shù) 2n 方式 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增 結(jié)果 原理 DNA雙鏈復(fù)制 PCR技術(shù) 前提 條件 PCR擴增儀 一段已知目的基因的核苷酸序列 模板DNA DNA引物 四種脫氧核苷酸 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 Taq酶 PCR技術(shù)的操作過程 a DNA變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 退火 復(fù)性55 65 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 d 重復(fù)a b c步驟 每重復(fù)一次 目的基因增加 倍 一 PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較 堿基互補配對原則 堿基互補配對原則 四種脫氧核苷酸 模板 酶 ATP 四種脫氧核苷酸 模板 酶 引物 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化解旋 半保留復(fù)制 邊解旋邊復(fù)制 半保留復(fù)制 全解旋再復(fù)制 體外復(fù)制 主要在細胞核內(nèi) 大量的DNA片段 形成整個DNA分子 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 細胞內(nèi)的DNA聚合酶 解旋酶等 反轉(zhuǎn)錄法 目的基因的信使RNA 目的基因 化學(xué)合成法 肽鏈氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 推測 推測 單鏈DNA 合成 3 人工合成 化學(xué)合成法 基因較小 核苷酸序列已知 可以利用DNA合成儀人工合成 變式遷移 1 多選 下圖表示限制酶切割某DNA的過程 從圖中可知 該限制酶能識別的堿基序列及切點是 A CTTAAGB GAATTCC 切點在G和A之間D 切點在C和T之間 P4 2 在遺傳工程中 若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG TACAC 要使其數(shù)量增多 可用PCR技術(shù)進行人工復(fù)制 復(fù)制時應(yīng)給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 引物 溫度變化 恒溫A B C D D 3 在基因工程中 把選出的目的基因 共1000個脫氧核苷酸對 其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個 放入DNA擴增儀中擴增4代 那么 在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是A 540個B 8100個C 17280個D 7560個 B 1000個脫氧核苷酸對 即2000個核苷酸 由于A T 460個 所以 C G 540個 所以 一個目的基因有胞嘧啶脫氧核苷酸540個 擴增4代可產(chǎn)生16個DNA分子 根據(jù)DNA半保留復(fù)制原則 其中有一個DNA分子 相當(dāng) 于親代的DNA 所以 在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸數(shù)為 16 1 540 8100個 4 在已知序列信息的情況下 獲取目的基因的最方便方法是A 化學(xué)合成法B 基因組文庫法C cDNA文庫法D 聚合酶鏈反應(yīng) 5 下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是 從基因文庫中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法 通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A B C D A D 二 基因表達載體的構(gòu)建 基因工程的核心 1 目的 所需物質(zhì) 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用 它們各自的作用是什么 2 基因表達載體的組成 復(fù)制原點 目的基因 啟動子 終止子 標(biāo)記基因 它們各自的作用是什么 啟動子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因 從而將有目的基因的細胞篩選出來 載體與表達載體的區(qū)別 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段 表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因 啟動子 終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶 既用到限制酶切割載體 又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接 兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子 終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞 必需以表達載體的方式攜帶進去 注意 啟動 終止 轉(zhuǎn)錄 啟動 終止 翻譯 作用 位于DNA上 位于mRNA上 位置 DNA片段 三個相鄰堿基 本質(zhì) 啟動 終止 子 啟始 終止 密碼子 三 將目的基因?qū)胧荏w細胞 1 轉(zhuǎn)化 2 方法 將目的基因?qū)胫参锛毎?將目的基因?qū)雱游锛毎?將目的基因?qū)胛⑸锛毎?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 感受態(tài)細胞 目的基因進入 內(nèi) 并且在受體細胞內(nèi)維持 和 的過程 受體細胞 穩(wěn)定 表達 1 將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點 易感染雙子葉植物和裸子植物 對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力 原理 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞 并整合到受體細胞染色體的DNA上 過程 優(yōu)點 經(jīng)濟和有效 2 基因槍法 3 花粉管通道法 2 將目的基因?qū)雱游锛毎?方法 顯微注射法 程序 目的基因表達載體提純?nèi)÷?受精卵 顯微注射受精卵新性狀動物 3 將目的基因?qū)胛⑸锛毎?原核生物特點 繁殖快 單細胞 遺傳物質(zhì)少 方法 用Ca2 處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子 四 目的基因的檢測與鑒定 導(dǎo)入過程完成后 全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎 真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少 目的基因進入受體細胞后 是否都能穩(wěn)定維持和表達 不一定 需要檢測 1 鑒定 分子水平的鑒定 轉(zhuǎn)基因生物的DNA 探針 15N 15N 1 檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 基因探針 指用熒光或放射性同位素標(biāo)記的DNA分子 方法 DNA分子雜交技術(shù) 變性 變性 1 鑒定 分子水平的鑒定 變性 方法 分子雜交技術(shù) 2 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 探針 15N 15N 轉(zhuǎn)基因生物的mRNA 1 鑒定 分子水平的鑒定 提取 3 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 方法 抗原 抗體雜交 Bt毒素蛋白 將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi) 從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體 抗體 蛋白質(zhì) 出現(xiàn)雜交帶 脫分化 組織培養(yǎng) 思考 不能 受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀 才能說明目的基因完成了表達 受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎 2 鑒定 個體水平的鑒定 抗蟲 抗病接種實驗 活性比較實驗 例 用棉鈴飼喂棉鈴蟲 如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀 說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達 如蟲吃后中毒死亡 則說明攝入了抗蟲基因并得到表達 變式遷移 4 下列技術(shù)中不是依據(jù)DNA分子雜交原理的是 A 檢測目的基因是否導(dǎo)入了受體細胞B 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄了mRNAC 檢測目的基因是否翻譯合成蛋白質(zhì)D 快速靈敏地檢測飲用水中病毒的含量 C 點評 1 涉及目的基因的檢測與鑒定習(xí)題時 應(yīng)注意審題 辨清是要求從 分子水平 還是從 個體水平 2 DNA探針及其應(yīng)用 DNA探針是指用熒光或放射性同位素標(biāo)記的DNA分子 其應(yīng)用依據(jù)的原理是DNA分子雜交 應(yīng)用 DNA探針可用來檢測DNA或RNA分子 因此其應(yīng)用廣泛 如a 從基因文庫中準確提取目的基因 b 檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因和檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA c 鑒定物種親緣關(guān)系 d 疾病的診斷和治療 e 環(huán)境監(jiān)測 歸納 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因 啟動子 終止子 標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測 是否插入 轉(zhuǎn)錄 翻譯鑒定 變式遷移 3 采用基因工程方法培育抗蟲棉 下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉花受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到受精卵中 將編碼毒素蛋白質(zhì)的DNA序列 與質(zhì)粒重組 導(dǎo)入細菌 用該細菌感染棉的體細胞再進行組織培養(yǎng) 將編碼毒素蛋白質(zhì)DNA序列與細菌質(zhì)粒重組 注射到棉的子房并進入受精卵A B C D P10 C 點評 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中有二次拼接和二次導(dǎo)入 第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒上T DNA的中間部位 第二次拼接 非人工操作 指被插入目的基因的T DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上 第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌 第二次導(dǎo)入 非人工操作 是指含目的基因的T DNA進入受體細胞 2 因為動物體細胞的全能性受到一定限制 故一般將目的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蚵鸭毎?而不是體細胞 而植物體細胞的全能性相對容易表達 故一般將目的基因?qū)胫参锏捏w細胞 然后再通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注 我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 1 獲得耐鹽基因后 構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的處 DNA連接酶作用于處 填 a 或 b a a 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注 我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 2 將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法 3 由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用技術(shù) 該技術(shù)的核心是和 4 為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素標(biāo)記的作探針進行分子雜交檢測 又要用方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性 基因槍法 花粉管通道法 植物組織培養(yǎng) 脫分化 去分化 再分化 耐鹽基因 目的基因 一定濃度鹽水澆灌 移栽到鹽堿地中 基因組文庫的構(gòu)建 2 基因文庫的構(gòu)建方法 通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因 cDNA文庫的構(gòu)建 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 目的基因的mRNA 單鏈DNA 反轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 雙鏈DNA 目的基因 1 基因組文庫 是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段 再與合適的載體在體外重組后 導(dǎo)入受體細菌的群體中儲存 這個群體就稱為該生物的基因組文庫 其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因 一 目的基因的獲取 一 從基因文庫中直接獲取 1 基因文庫 1 原核細胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點 啟動子 終止子 啟動子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶 能夠識別啟動子上結(jié)合位點的一種蛋白質(zhì) 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA 能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 原核細胞的基因結(jié)構(gòu) 有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列 包括啟動子和終止子 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 啟動子 終止子 2 真核細胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 與RNA聚合酶結(jié)合位點 內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子 啟動子 終止子 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 內(nèi)含子 外顯子 真核細胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 外顯子 能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子 不能編碼蛋白質(zhì)的序列 有調(diào)控作用的核苷酸序列 包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點 啟動子 非編碼序列 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子 3 原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較 思考 編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì) 原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎 連續(xù) 不連續(xù) 編碼區(qū) 非編碼