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第五章維生素類藥物的分析TheAnalysisofVitamines 維生素是維持人體正常生理機能所必需的生物活性物質(zhì) 如果人體缺少某種維生素 就會引起維生素缺乏癥 而影響人體的正常生理機能 例如 VA缺乏 夜盲癥VB1缺乏 腳氣病 概述 脂溶性 水溶性 按溶解性分類 VA VD VE VK等 B族 VB1 VB2等 VC 煙酸 葉酸 泛酸等 第一節(jié)維生素A的分析 一 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1 化學(xué)結(jié)構(gòu) R HVA醇VA1R COCH3VA醋酸酯R COC15H31VA棕櫚酸酯 1 環(huán)己烯 共軛多烯側(cè)鏈 2 天然VA側(cè)鏈為全反式 3 天然來源主要是魚肝油 為醋酸酯 棕櫚酸酯等 目前多由人工合成 結(jié)構(gòu)特點 a 紫外吸收 具有共軛多烯側(cè)鏈 紫外吸收 最大吸收波長在325 328nm 隨VA存在狀態(tài)以及所用的溶劑 最大吸收波長的位置有所不同 2 性質(zhì) 不溶于水 溶于乙醚 氯仿 異丙醇 環(huán)己烷 脂肪和油 b 溶解性 共軛多烯側(cè)鏈 性質(zhì)非?；顫?c 不穩(wěn)定性 維生素A的氧化產(chǎn)物 環(huán)氧化物 維生素A醛 維生素A酸 or 鑒別 含量測定 d 與SbCl3作用 Carr Price反應(yīng) 無水 二 鑒別試驗1 三氯化銻反應(yīng) 無水 2 紫外吸收光譜VA的無水乙醇溶液在326nm有最大吸收 確認(rèn)醇或酯 是醋酸酯或其他酸酯 例 VA和其標(biāo)準(zhǔn)品用環(huán)己烷溶解展開劑 環(huán)己烷 乙醚 80 20 板 硅膠G顯色 SbCl3T S Rf VA醇0 08VA醋酸酯0 41VA棕櫚酸酯0 75 3 TLC 三 含量測定 1 概述 共軛多烯的結(jié)構(gòu) 具有特征的紫外吸收 相關(guān)物質(zhì) 結(jié)構(gòu)相似 維生素A最大吸收波長附近也有吸收 對測定有影響 Morton和Stubbs等人提出了三點校正法 紫外分光光度法 三點校正法 2 原理 根據(jù) 假定 物質(zhì)對光的吸收具有加和性 即 維生素A中的不相關(guān)吸收在310 340nm范圍內(nèi)近似一條直線 效價為維生素A1的40 max345 350nm 3 相關(guān)物質(zhì)的吸收 a 維生素A的衍生物 維生素A2去氫維生素A 效價低于維生素A1 max385 390nm b 維生素A的氧化產(chǎn)物已介紹 維生素A3去水維生素A c 合成時的中間體 側(cè)連有4個雙鍵 應(yīng)有種異構(gòu)體 目前 包括維生素A在內(nèi) 共發(fā)現(xiàn)有6種異構(gòu)體 它們是 e 維生素A異構(gòu)體 d 鯨醇維生素A醇的二聚體 沒有生物活性 新維生素Aa 新維生素Ab 新維生素Ac 異維生素Aa 異維生素Ab 維生素A 1 維生素A的 max 2 3 分別在 1兩側(cè) 4 三個波長的選擇方法 等波長差法 1 328nm 2 316nm 3 340nm 這兩個波長分別在 1兩側(cè)12nm處 即 等吸光度法 1 325nm 2 310nm 3 334nm VA在這兩個波長下的吸光度應(yīng)該等于 1下的吸光度的 即 5 方法 Chp收載有2種方法 第一法 適用于酯式維生素A的測定 a 操作方法 最大吸收波長確認(rèn) max在326 329nm 第一法測定 max不在326 329nm 第二法測定 b 計算方法 計算吸收度比及比值差 首先要計算吸收度比值 然后計算吸收度的比值差 計算校正吸收度 吸收度校正公式 換算因數(shù) 定義 每一個數(shù)值所相當(dāng)?shù)男r 1IU 0 344 g全反式維生素A醋酸酯 1g的維生素A醋酸酯就相當(dāng)于 維生素A醋酸酯 練習(xí)題 維生素AD膠丸中維生素A的含量測定已知 平均膠丸重為0 0815g維生素A的標(biāo)示量為10000IU 丸取樣 求 維生素A的標(biāo)示百分含量 測定數(shù)據(jù)如下表 首先要求樣品的 根據(jù)比爾定律 A為測得吸收度or校正吸收度 首先計算吸收度比值和吸收度比值差 填于上表 由此可知 應(yīng)該用測得的328nm處的吸收度計算 然后計算校正吸收度與未校正吸收度相差的百分?jǐn)?shù) 由結(jié)果知 需計算校正吸收度 所以 維生素A的標(biāo)示含量 這樣 第二法 皂化法 消除植物油干擾 適合VA醇 b 在300 310 325和334nm處測定吸收度 找出 maxc 計算d 校正公式A325 校 6 815A325 2 555A310 4 260A334e 判斷 5 注意事項 1 VA遇光易氧化變質(zhì) 操作應(yīng)半暗室中快速進行 所用試劑不得含氧化性物質(zhì) 以防VA紫外線或氧化性物質(zhì)破壞 2 用三校正法測定時 一點在 max處 其余兩點均為吸收曲線的上升和下降陡坡處 對波長的正確性要求嚴(yán)格 340nm處 若波長誤差 0 5nm 可影響結(jié)果 3 1 2 07 所以測定時所用儀器的波長讀數(shù)應(yīng)注意 必要時應(yīng)作標(biāo)準(zhǔn) 維生素A醋酸酯膠丸含量測定 取內(nèi)容物39 1mg 加環(huán)己烷溶解并稀釋成100ml 在下列五個波長處測得吸收度A值如下 已知 平均膠丸內(nèi)容物重為0 08736g 維生素A的標(biāo)示量為3000IU 丸試求 維生素A的標(biāo)示百分含量 維生素A醋酸酯膠丸的含量測定 取內(nèi)容物W 加環(huán)己烷溶解并稀釋至10ml 搖勻 精密量取0 1ml 再加環(huán)己烷稀釋至10ml 使其濃度為9 15IU ml 已知內(nèi)容物平均重量為80 0mg 每丸標(biāo)示量為10000IU 試計算取樣量 W 的范圍是多少 第二節(jié)維生素E的分析 名稱 消旋 生育酚醋酸酯母核 苯駢二氫吡喃衍生物苯環(huán)上有一乙酰化的酚羥基側(cè)鏈 脂肪烷烴 一 化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 二 鑒別試驗1 硝酸反應(yīng) 本品 無水乙醇溶解 加硝酸 75 加熱約15分鐘 顯橙紅色 2 水解后氧化反應(yīng) 本品 在堿性條件下水解 得 生育酚 在聯(lián)吡啶和三氯化鐵試液的作用下 反應(yīng)產(chǎn)生血紅色配離子 3 UV吸收 VE的0 01 無水乙醇液 max 284nm min 254nm 三 雜質(zhì)檢查檢查游離生育酚 ChP2000P798取0 1g樣品 按鈰量法用Ce SO4 2 0 01mol L 滴定 以二苯胺為指示劑 消耗Ce SO4 2液不得超過1 0ml 一 鈰量法1 原理 VE用硫酸加熱回流 水解成生育酚 用硫酸鈰定量地氧化為對一生育醌 過量的硫酸鈰氧化二苯胺指示劑而指示滴定終點 終點 亮黃 灰紫空白試驗 四 含量測定 2 反應(yīng)條件 1 VE在H2SO4酸性條件下水解為宜 堿性溶液中游離生育酚易被氧化 Ce SO4 2液滴定在酸性溶液中進行 如在堿性中會生成堿式鹽而影響測定 2 Ce SO4 2溶于酸水溶液 不溶于醇 生育酚溶于酸而不溶于水 滴定過程中應(yīng)有一定濃度的乙醇 3 本法適用于純度高的VE供試品 二 氣相色譜法 Chp20001 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗色譜柱 2m 4mmI D 硼硅玻璃柱 內(nèi)裝硅藻土 80 100目 固定相 硅酮 OV 17 涂布濃度2 載氣 N2 流速 含2 固定相 以18 20分鐘為宜 含5 固定相 以30 32分鐘為宜 柱溫 265 內(nèi)標(biāo) 正三十二烷檢測器 FID 氫火焰離子化檢測器 性能要求 理論塔板數(shù)按VE峰計算應(yīng)不低于500 VE峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于2 2 溶液配制 內(nèi)標(biāo)溶液 正三十二烷的環(huán)己烷溶液 1 0mg ml 對照溶液 對照品溶解于內(nèi)標(biāo)溶液中 1mg ml 供試品溶液 供試品約50mg 用內(nèi)標(biāo)溶液 溶解并稀釋至50ml 4 供試品測定mg F Ax Ms AsAx 供試品峰面積F 校正因子As 內(nèi)標(biāo)物的峰面積5 特點 1 簡便快速 專屬性強 適用于VE VE制劑及多種維生素制劑中VE的測定 2 需要特殊儀器 三 高效液相色譜法日本藥局方 JP13 色譜條件 柱 ODS流動相 甲醇 水 49 1 檢測波長 292nm對照品法定量 第三節(jié)維生素B1的分析 一 化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1 結(jié)構(gòu) 氯化3 4 氨基 2 甲基嘧啶 5 甲基 5 2 羥乙基 4 甲基噻唑的鹽酸鹽 2 結(jié)構(gòu)特點 a 氨基嘧啶 次甲基 噻唑環(huán)季銨化合物 b 堿性基團 嘧啶環(huán)上的氨基可與酸成鹽噻唑環(huán)上的季銨 3 性質(zhì) 硫色素反應(yīng)VB1噻唑環(huán)在堿性條件下可被鐵氰化鉀K3Fe CN 6等一些氧化劑氧化后 與嘧啶環(huán)上的氨基縮合成具有熒光的硫色素 沉淀反應(yīng)VB1的含氮雜環(huán) 能和生物堿沉淀試劑反應(yīng)產(chǎn)生沉淀 如 VB1與硅鎢酸反應(yīng)可生成組成一定的沉淀 重量法測定VB1含量 硫胺顯堿性具有兩個堿性基團 噻唑環(huán)上的季銨 嘧啶環(huán)上的氨基可以和酸成鹽 如 鹽酸硫胺 硝酸硫胺 加堿分解后與醋酸鉛反應(yīng)VB1與NaOH試液一起加熱 分解產(chǎn)生NaS 可與PbAc2反應(yīng)生成PbS的黑色沉淀 維生素B1的水溶液顯氯化物的特征反應(yīng) 二 鑒別試驗 1 硫色素?zé)晒夥磻?yīng) VB1專屬反應(yīng) 用于鑒別和含量測定 2 沉淀反應(yīng) 可與某些生物堿沉淀試劑生成組成恒定的沉淀如 與碘化汞鉀產(chǎn)生淡黃色沉淀與碘生成紅色沉淀與硅鎢酸生成白色沉淀與苦味酸生成扇形白色結(jié)晶 三 含量測定非水滴定法 ChP所用方法 硅鎢酸重量法銀量法硫色素?zé)晒夥ㄗ贤夥止夤舛确ū壬ńj(luò)合滴定法 一 非水溶液滴定法 1 原理 VB1分子中含有已成鹽的伯胺和季銨基團 在非水溶液中 在醋酸汞存在下 均可被高氯酸滴定 2 方法 溶劑 冰醋酸指示劑 喹哪定紅 亞甲藍混合指示液滴定劑 高氯酸醋酸汞 終點 天藍色空白校正 T 16 86mg ml 二 硅鎢酸重量法 2VB1 硅鎢酸 白色沉淀 4HCl 1 原理 VB1在酸性溶液中與硅鎢酸作用產(chǎn)生沉淀 根據(jù)沉淀的重量和供試品的重量即可計算其含量 2 計算 2VB1的分子量為2 337 27沉淀的分子量為3479 22換算因數(shù) 0 1939 含義 1g沉淀相當(dāng)于0 1939gVB1 3 測定方法 4 實驗條件 1 取樣量 應(yīng)在50mg左右 不得少于25mg 2 加入鹽酸的目的 易于過濾 酸量不足 沉淀的顆粒過細 酸量過多 無太大影響 3 硅鎢酸的用量 硅鎢酸 VB1 8 1用量不足 導(dǎo)致結(jié)果偏低 4 干燥溫度 80 干燥3hr 至恒重 沉淀含4分子結(jié)晶水 換算因數(shù)為0 1939 5 硅鎢酸的加入速度用滴管一滴一滴加入 純度高快加 純度低慢加 防止沉淀表面吸附的雜質(zhì)來不及離開而被沉淀包圍 6 煮沸時間2 5min為宜 使沉淀顆粒大 利于過濾洗滌 7 沉淀的洗滌用熱稀鹽酸洗滌 洗滌液用量不得多于50ml 否則 沉淀會部分溶解 8 洗器用4號垂熔玻璃漏斗為宜 4 重量法特點 1 比較準(zhǔn)確 靈敏 2 方法簡便 不需要特殊儀器 3 恒重比較費時間 第四章維生素C的分析一 化學(xué)結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)特點 維生素C分子中具有2個手性C原子 具有4種光學(xué)異構(gòu)體 其中生理活性最強的是L 抗壞血酸 D 異抗壞血酸 L 異抗壞血酸 L 抗壞血酸 D 抗壞血酸 具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu) 堿性下可水解 具有烯二醇基 還原性 能夠被氧化成去氫抗壞血酸 酸性 能與堿成鹽 二 性質(zhì)與鑒別試驗1 酸性烯二醇結(jié)構(gòu) 酸性 C3 OH pKa 4 17 共軛效應(yīng) C2 OH pKa 11 57 鄰位羰基 一元酸 能與NaHCO3作用生成鈉鹽 2 還原性烯二醇基 還原性 如 3 水解反應(yīng) L 二酮古羅糖酸 無生物活性 4 熒光反應(yīng) 5 糖的性質(zhì)VC的結(jié)構(gòu)很象糖結(jié)構(gòu) 具有糖的性質(zhì) 這個反應(yīng)的摩爾比是1 2 三 含量測定 1 碘量法 a 原理 b 操作 終點顏色 無色 藍色1ml0 1mol L碘液1ml 8 806mgC6H8O6 c 討論 反應(yīng)條件 酸性使VC在空氣中氧化速度減慢 溶劑 新沸放冷的水 減少水中溶解氧的影響 還原性物質(zhì)的影響及排除 VC注射液中常加有亞硫酸鹽如NaHSO3作為抗氧劑 排除 加入丙酮或甲醛 2 2 6 二氯吲哚酚滴定法原理 在酸性下氧化型是紅色的 還原型是無色的酸性下直接用2 6 二氯吲哚酚滴定 用滴定劑自身的顏色變化指示終點 不需要另外的指示劑 所以 終點的顏色是溶液由無色變?yōu)榧t色 氧化型 紅色 還原型 無色