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第十四章維生素類藥物的分析 公元前3500年 古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì) 也就是后來的維A 1600年 醫(yī)生鼓勵(lì)以多吃動(dòng)物肝臟來治夜盲癥 1747年 蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病 也就是后來的維C 1831年 胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn) 1911年 波蘭化學(xué)家豐克為維生素命名 1915年 科學(xué)家認(rèn)為糙皮病是由于缺乏某種維生素而造成的 1916年 維生素B被分離出來 1917年 英國醫(yī)生發(fā)現(xiàn)魚肝油可治愈佝僂病 隨后斷定這種病是缺乏維D引起的 1920年 發(fā)現(xiàn)人體可將胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為維生素A1922年 維E被發(fā)現(xiàn) 1928年 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)維B至少有兩種類型 1933年 維E首次用于治療 1948年 大劑量維C用于治療炎癥 1949年 維B3與維C用于治療精神分裂癥 1954年 自由基與人體老化的關(guān)系被揭開 1957年 Q10多酶被發(fā)現(xiàn) 1969年 體內(nèi)超級(jí)抗氧化酶被發(fā)現(xiàn) 1970年 維C被用于治療感冒 1993年 哈佛大學(xué)發(fā)表維生素E與心臟病關(guān)系的研究結(jié)果 VitA D2 D3 E K1等 脂溶性 水溶性 VitB族 B1 B2 B6 B12 VitC 葉酸 煙酸 泛酸等 分類 按溶解度分 第一節(jié)維生素A的分析 分類 A1 A2 A3A1存在于動(dòng)物肝臟 血液和眼球的視網(wǎng)膜中 又稱為視黃醇 天然維生素A主要以此形式存在 脂溶性淡黃色片狀結(jié)晶 熔點(diǎn)64 A2主要存在于淡水魚的肝臟中 維生素A2的化學(xué)結(jié)構(gòu)與A1的區(qū)別只是在 白芷酮環(huán)的3 4位上多一個(gè)雙鍵 功能 維持視覺 維生素A可促進(jìn)視覺細(xì)胞內(nèi)感光色素的形成 維生素A可調(diào)試眼睛適應(yīng)外界光線的強(qiáng)弱的能力 以降低夜盲癥和視力減退的發(fā)生 維持正常的視覺反應(yīng) 有助于對(duì)多種眼疾 如眼球干燥與結(jié)膜炎等 的治療 2 促進(jìn)生長發(fā)育 與視黃醇對(duì)基因的調(diào)控有關(guān) 視黃醇也具有相當(dāng)于類固醇激素的作用 可促進(jìn)糖蛋白的合成 促進(jìn)生長 發(fā)育 強(qiáng)壯骨骼 維護(hù)頭發(fā) 牙齒和牙床的健康 3 維持上皮結(jié)構(gòu)的完整與健全 視黃醇和視黃酸可以調(diào)控基因表達(dá) 減弱上皮細(xì)胞向鱗片狀的分化 增加上皮生長因子受體的數(shù)量 保持皮膚濕潤 防止皮膚黏膜干燥角質(zhì)化 不易受細(xì)菌傷害 有助于對(duì)粉刺 膿包 癤瘡 皮膚表面潰瘍等癥的治療 4 加強(qiáng)免疫能力維生素A有助于維持免疫系統(tǒng)功能正常 能加強(qiáng)對(duì)傳染病特別是呼吸道感染及寄生蟲感染的身體抵抗力 有助于對(duì)肺氣腫 甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥的治療 富含維生素A的食物 梨 蘋果 枇杷 櫻桃 香蕉 桂圓 杏子 荔枝 西瓜 甜瓜 水果類 蔬菜類 馬齒菜 大白菜 薺菜 番茄 茄子 南瓜 黃瓜 菠菜 植物類 綠豆 大米 胡桃仁 一 結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 一 結(jié)構(gòu) R H維生素A醇 COCH3維生素A醋酸酯 COC15H31維生素A棕櫚酸酯 一個(gè)共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯 有立體異構(gòu)體 醋酸酯相對(duì)生物效價(jià)維生素A325 5100 新維生素Aa32875 新維生素Ab320 524 新維生素Ac310 515 異維生素Aa32321 異維生素Ab32424 二 性質(zhì)1 具紫外吸收 在325 328nm間有最大吸收2 不穩(wěn)定性 易氧化變質(zhì) 易被空氣中氧或氧化劑氧化 易被紫外光裂解 在加熱和金屬離子存在時(shí) 更易氧化變質(zhì) 生成無生物活性的環(huán)氧化物 維生素A醛及維生素A酸 或有金屬離子存在時(shí)氧化 3 能與三氯化銻呈色 產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色 4 溶解性 維生素A能與氯仿 乙醚 環(huán)己烷或石油醚任意混合 在乙醇中微溶 在水中不溶 二 鑒別試驗(yàn) 一 三氯化銻反應(yīng)原理 維生素A在飽和無水三氯化銻的無醇氯仿溶液中 即顯藍(lán)色 漸變成紫紅色 注意 鑒別在無水 無醇 乙醇可以和碳正離子作用使其正電荷消失 條件下進(jìn)行 CHCl3 水中水解為氯化氧銻 二 紫外吸收光譜 5個(gè)共軛雙鍵 6個(gè)共軛雙健 去水VitA VitA3 VitA 三 薄層色譜吸附劑 硅膠G展開劑 環(huán)己烷 乙醚 80 20 點(diǎn)樣量 各2 l 不必?fù)]散溶劑 立即展開顯色劑 三氯化銻溶液結(jié)論 比較供試品溶液和對(duì)照品溶液所顯藍(lán)色斑點(diǎn)位置 BP雜質(zhì)對(duì)照品法顯色劑三氯化銻USP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值 立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體副產(chǎn)物 UV法 一 維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸 1 方法建立的依據(jù) 三點(diǎn)校正法 2 測(cè)定原理方法的依據(jù) 主成分 在325 328nm有吸收 雜質(zhì) 在310 340nm范圍內(nèi)吸收呈一條直線 且隨波長的增大 吸收度變小 物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性 3 三點(diǎn)波長的選擇 1 第1點(diǎn) 選擇維生素A的最大吸收波長 1 2 第2點(diǎn)和第3點(diǎn) 在 max兩側(cè)各選一點(diǎn) 等波長差法 3 1 1 2測(cè)定VA醋酸酯 規(guī)定 1 328nm 入2 316nm 3 340nm 等吸收度法 A 2 A 3 6 7A 1測(cè)定VA醇 規(guī)定 1 325nm 2 310nm 3 334nm 4 雜質(zhì)吸收 1 維生素A2和維生素A3 2 維生素A的氧化產(chǎn)物為環(huán)氧化物 維生素A醛和維生素A酸 3 維生素A在光照下產(chǎn)生的無生物活性的聚合物鯨醇 4 維生素A的異構(gòu)體 5 合成時(shí)產(chǎn)生的中間體 1 5 這些雜質(zhì)在310 340nm波長范圍內(nèi)有吸收 因此 在測(cè)定維生素A含量時(shí) 必須考慮這些雜質(zhì)的干擾 三點(diǎn)校正法可以消除這些雜質(zhì)的影響 5 測(cè)定方法 1 基本步驟 第一步A的選擇選擇依據(jù) 所選A值中雜質(zhì)的干擾已被基本消除 第二步 求百分吸收系數(shù) 注意 C為混合樣品的濃度 第三步求效價(jià) 換算因數(shù)由純品計(jì)算而得 第四步 求標(biāo)示量 2 第一法 等波長差法 高純度VA醋酸酯測(cè)量方法 計(jì)算各波長下的吸收度與328nm波長下的吸收度的比值 判斷是否在326 329nm之間 在326 329nm之間 改用第二法 是 否 求算并與規(guī)定值比較 規(guī)定值差值 判斷前提 最大吸收波長在326 329nm之間 第二法 第二法 討論 VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法 即代數(shù)法 推導(dǎo)而來 VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法 幾何法或稱6 7定位法 推導(dǎo)而來 在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí) 除其中一點(diǎn)在最大吸收波長處測(cè)定外 其余兩點(diǎn)均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定 在測(cè)定前務(wù)必要校正波長 測(cè)定的樣品應(yīng)不得少于兩份 3 第二法皂化法 適用于維生素A醇 加熱回流 判斷 max是否在323 327nm之間 取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定 計(jì)算 是 否 0 73進(jìn)一步判斷 0 73 雜質(zhì)含量過高 0 3 3 二 三氯化銻比色法 優(yōu)點(diǎn)簡便快速 max618nm 620nm 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 三 高效液相色譜法 RP HPLC同時(shí)測(cè)定人血清中VitA和VitE的含量 1 儀器與分析條件 HPLC UV C18 300 3 9mm 甲醇 水 96 4 流速 1 2ml min 檢測(cè)波長 0 8min 330nm 8min后 292nm 內(nèi)標(biāo) 維生素A醋酸酯 血清樣品的制備 LLE法制備分析方法的建立 線性LODRecoveryPrecisionChromatogram 作業(yè) 維生素AD膠丸中維生素A醋酸酯的測(cè)定方法如下 取內(nèi)容物0 0410g 加環(huán)己烷溶解并稀釋至50ml 搖勻 取出2ml加環(huán)己烷溶解并稀釋至25ml 搖勻 在下列5個(gè)波長處測(cè)定吸光度如下 已知 平均丸重 平均內(nèi)容物重 0 0910g 標(biāo)示量10000IU 丸 求維生素A醋酸酯的標(biāo)示量 第二節(jié)維生素Bl的分析 二 結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 一 結(jié)構(gòu) 氨基嘧啶環(huán) CH2 噻唑環(huán) 季銨堿 HCl Cl 存在于米糠 麥麩和酵母中人工合成 二 性質(zhì) 1 溶解性 在水中易溶 水溶液顯酸性在乙醇中微溶 在乙醚中不溶 2 具有紫外吸收 max 246nm HCl溶液 3 硫色素反應(yīng) 具有熒光 4 堿性 可與酸成鹽 與生物堿沉淀試劑反應(yīng) 生成組成恒定的沉淀 5 氯化物特性 嘧啶環(huán) 伯胺噻唑環(huán) 季銨 碘化汞鉀 三硝基酚 碘溶液 硅鎢酸等 三 鑒別試驗(yàn) 一 硫色素反應(yīng) 維生素B1的專屬反應(yīng)原理 硫色素 O 注意事項(xiàng) 1 硫色素反應(yīng)為維生素Bl的專屬反應(yīng) 雖非定量完成 但在一定條件下形成的硫色素與維生素Bl濃度成正比 且回收恒定 故可用于維生素Bl及其制劑的含量測(cè)定 2 本法為維生素B1所特有 故不受氧化破壞產(chǎn)物的干擾 測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確 但操作繁瑣 且熒光測(cè)定受多種因素干擾 3 本法中使用的氧化劑 除鐵氰化鉀外 尚可用氯化汞或溴化氰 其中 溴化氰能將維生素Bl完全定量地氧化為硫色素 在較寬的濃度范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度成正比 且尿液中某些代謝產(chǎn)物不干擾測(cè)定 故亦適用于臨床體液分析 VitB1 H H H H S元素反應(yīng) Cl 反應(yīng) NaOH 四 含量測(cè)定非水溶液滴定法 原料 和紫外分光光度法 制劑 硫色素?zé)晒夥?USP 24 一 非水滴定法1 原理 含有兩個(gè)堿性的已成鹽的伯胺和季銨基團(tuán) 在非水溶液中可與高氯酸作用 用于含量測(cè)定 喹那啶紅 亞甲藍(lán) 紫紅 天藍(lán) 2 方法 用冰醋酸作溶劑 滴加醋酸汞 以喹哪啶紅 亞甲藍(lán)混合物作指示劑 高氯酸作滴定液 3 注意事項(xiàng) 1 加醋酸汞 2 滴定度為16 86mg ml VB1有兩個(gè)堿性基團(tuán) 與高氯酸反應(yīng)的摩爾比為1 2 3 非水容量法可用于弱酸性特別是弱堿性藥物及其鹽類的含量測(cè)定 4 此處僅適用于維生素B1的原料藥含量測(cè)定 二 紫外分光光度法1 原理 2 VB1片的含量測(cè)定測(cè)定方法 以鹽酸溶液 9 1000 作溶劑 在246nm測(cè)定吸收度 按Cl2Hl7ClN4OS HCl的吸收系數(shù) 百分吸收系數(shù) 為421計(jì)算 即得 片劑 注射劑 421 每片 相當(dāng)于標(biāo)示量的 A ECL 規(guī)格g 片 g 100ml g ChP 每ml 相當(dāng)于標(biāo)示量的 規(guī)格g ml ml 差示分光光度法 簡稱 A法取兩份相等的供試液 一份加酸 另一份加堿或緩沖液或其他能夠發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)的試劑 有時(shí)也可不加任何溶液 然后將兩者分別稀釋至同樣濃度 一份置樣品池中 另一份置參比池中 于適當(dāng)波長處 測(cè)其吸收度的差值 A值 在供試溶液的一定濃度范圍內(nèi) A值與濃度C之間呈線性關(guān)系 優(yōu)點(diǎn) 在不同pH介質(zhì)中 或經(jīng)適當(dāng)化學(xué)反應(yīng)后 供試物發(fā)生了特征性的光譜變化 而賦形劑或其他共存物質(zhì)不受pH條件或化學(xué)試劑的影響 未引起光譜變化 從而消除了它們的干擾 差示分光光度法 A法使用 1 利用最大吸收波長進(jìn)行藥物的測(cè)定 紫外光譜對(duì)pH十分敏感時(shí) 可測(cè)得 A 堿 酸 或 A pH7 酸 2 利用最大吸收與最小吸收之差 即振幅 進(jìn)行藥物測(cè)定 某些藥物共存物在某pH范圍內(nèi)的光譜與pH無關(guān) 即吸收度不變 而主藥有最大和最小吸收 兩者差值與主藥濃度成正比 差示分光光度法 A法使用 3 利用干擾雜質(zhì)等吸收波長進(jìn)行測(cè)定 于干擾物的等吸收波長處進(jìn)行測(cè)量 如測(cè)得供試物的相應(yīng)吸收度 即可消除共存物的干擾 4 利用最小吸收波長 lmin 處的增色效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定 某些藥物在堿性和酸性溶液中吸收重疊 但吸收值不同 但在堿性或酸性溶液中于lmax或lmin處可產(chǎn)生增色效應(yīng) 利用此效應(yīng)可測(cè)定藥物濃度 通過與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的比較即可測(cè)得供試品含量 2 實(shí)驗(yàn)操作40ml具塞試管3支 對(duì)照品溶液5ml 其中2支加入氧化試劑3 0ml 再迅速加入異丁醇20ml 振搖 第三支試管中加入3 5mol l的NaOH 同法操作為空白 另取三支試管加入供試品 同法操作 各試管中加入無水乙醇2ml 分取異丁醇 進(jìn)行熒光測(cè)定 3 結(jié)果計(jì)算 式中 A和S分別為供試品和對(duì)照品溶液測(cè)得的平均熒光讀數(shù) b和d則分別為其相應(yīng)的空白讀數(shù) 0 2為對(duì)照品溶液的濃度 g ml 5為測(cè)定時(shí)對(duì)照品溶液的取樣體積 ml 1 靈敏度高 線性范圍寬 2 代謝產(chǎn)物不干擾 適用于體液分析 3 該法適用于VitB1的制劑含量分析 4 可用BrCN為氧化劑 反應(yīng)定量完全 適合于生物樣本分析 第三節(jié)維生素C的分析 功效 1 促進(jìn)膠原蛋白的合成2 治療壞血病3 預(yù)防牙齦萎縮 出血4 預(yù)防動(dòng)脈硬化5 抗氧化劑6 治療貧血7 防癌8 保護(hù)肝臟的解毒能力和細(xì)胞的正常代謝9 提高人體的免疫力10 提高機(jī)體的應(yīng)急能力 維生素C有四種光學(xué)異構(gòu)體 其中以L 構(gòu)型右旋體的生物活性最強(qiáng) 藥典 維生素C原料 片劑 泡騰片 顆粒劑和注射劑 一 結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 一 結(jié)構(gòu) 具有烯二醇結(jié)構(gòu)和內(nèi)酯環(huán) 在C4 C5有兩個(gè)手性碳原子 性質(zhì)活潑 具有旋光性 二 性質(zhì)1 溶解性 水中易溶 乙醇中略溶 在氯仿或乙醚中不溶 水溶液呈酸性 C3 OH的pKa 4 17 C2 OH的pKa 11 57 一元酸 與碳酸氫鈉成鹽 2 具有酸性 烯二醇結(jié)構(gòu) 抗壞血酸 二酮基結(jié)構(gòu) 去氫抗壞血酸 烯二醇結(jié)構(gòu) o 2H 2H 3 強(qiáng)還原性 有活性 有活性 無活性 L 二酮古洛糖酸 L 抗壞血酸活性最強(qiáng) 手性C C4 C5 4 光學(xué)活性 與堿反應(yīng) 內(nèi)酯環(huán) 5 水解性 糖類的顯色反應(yīng) 50 結(jié)構(gòu)與糖類相似 6 糖類的性質(zhì) 7 紫外吸收特性 二 鑒別試驗(yàn) 一 利用VC所具有的強(qiáng)還原性 1 與硝酸銀反應(yīng) 1 方法 取本品0 2g 加水l0ml溶解 取該溶液5m1 加硝酸銀試液0 5m1 即生成銀的黑色沉淀 2 原理 烯二醇基 具強(qiáng)還原性 2 與2 6 二氯靛酚反應(yīng) 1 方法 取本品0 2g 加水l0ml溶解 取該溶液5m1 加2 6 二氯靛酚試液1 2滴 試液的顏色即消失 原理 氧化型 玫瑰紅色 玫瑰色 無色 3 與其他氧化劑反應(yīng)亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色堿性酒石酸銅磚紅色沉淀磷鉬酸鉬藍(lán) 或鹽酸 吡咯 50 二 利用維生素C所具有糖類性質(zhì)的反應(yīng) H 吡咯 三 利用VC所具有的紫外吸收特性維生素C在0 0lmol L鹽酸液中 在243nm波長處有惟一的最大吸收 利用此特征進(jìn)行鑒別 BP中采用該法 并規(guī)定其吸收系數(shù)應(yīng)為545 585之間 四 薄層色譜 三 雜質(zhì)檢查1 溶液的澄清度與顏色 有色雜質(zhì)分光光度法2 鐵 銅離子 原子吸收分光光度法3 草酸的檢查 四 含量測(cè)定具有較強(qiáng)的還原性 可被不同氧化劑定量氧化 一 碘量法1 原理 指示劑淀粉指示液 H 取本品約0 2g 精密稱定 加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解 加淀粉指示液1ml 立即用碘滴定液 0 1mol L 滴定 至溶液顯藍(lán)色 在30秒內(nèi)不褪 每1ml碘滴定液 0 1mol L 相當(dāng)于8 806mg的C6H8O6 3 注意事項(xiàng) 防止樣品氧化減慢VitC被O2氧化速度 用新沸冷水作溶劑趕走水中O2 應(yīng)用范圍廣對(duì)維生素C原料 維生素C片 維生素C泡騰片 維生素C注射液 維生素C顆粒劑等的含量測(cè)定均采用 差別僅在前處理 為了消除制劑中輔料對(duì)測(cè)定的干擾 滴定前要作些必要的處理 4 附加劑干擾的排除 片劑 滑石粉 過濾 USP JP 2 快速滴定2min內(nèi) 1 酸性環(huán)境HPO3 HAc 穩(wěn)定VitC 防止其他還原性物質(zhì)干擾 3 剩余比色測(cè)定 定量過量 測(cè)剩余染料 4 缺點(diǎn) 需經(jīng)常標(biāo)定 貯存 一周 干擾多氧化力較強(qiáng) 三 高效液相色譜法 人血漿中VitC濃度的HPLC法測(cè)定 1 色譜條件2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備3 血漿樣品的處理 酸性溶液沉淀蛋白法4 方法學(xué)考察5 測(cè)定 是抗佝僂病維生素的總稱 收載有 維生素D2 D3原料藥 維生素D2膠丸和注射劑 維生素D3注射劑等 第四節(jié)維生素D的分析 維生素D3 膽骨化醇 一 結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 維生素D2 骨化醇 24 一 結(jié)構(gòu) 二 性質(zhì) 1 性狀 D2 D3無臭 無味 遇光易變質(zhì)2 溶解性 在植物油中略溶 水中不溶3 不穩(wěn)定性 含有多個(gè)烯鍵 不穩(wěn)定 易氧化變質(zhì)降低效價(jià) 毒性增加 4 旋光性 維生素D2有6個(gè)手性碳原子維生素D3有5個(gè)手性碳原子5 顯色反應(yīng) 甾醇類化合物共有6 紫外吸收特性 二 鑒別試驗(yàn) 一 顯色反應(yīng) 2 三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅 3 三氯化鐵反應(yīng)橙黃色 4 二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色 漸變 漸變 迅即 迅即 二 比旋度鑒別 維生素D2 維生素D3 溶劑 濃度 比旋度值 無水乙醇 無水乙醇 40mg ml 5mg ml 102 5 107 5 105 112 注意事項(xiàng) 應(yīng)于容器開啟30分鐘內(nèi)取樣在溶液配制后30分鐘內(nèi)測(cè)定 三 區(qū)別反應(yīng) 以96 乙醇為溶劑 加乙醇和85 硫酸 D2顯紅色 在570nm處有最大吸收 D3顯黃色 在495nm處有最大吸收 4 其他方法 TLC HPLC 制備衍生物測(cè)熔點(diǎn) 三 雜質(zhì)檢查 維生素D2中麥角甾醇的檢查 加洋地黃皂苷溶液 混合 放置18h不得發(fā)生渾濁或沉淀 前維生素D的光照產(chǎn)物 四 含量測(cè)定方法 中國藥典采用正相高效液相色譜法 NP HPLC 測(cè)定維生素D的含量 定量方法為內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二甲酸二甲酯 根據(jù)樣品的具體情況按以下三個(gè)方法進(jìn)行分析 第一法 用于無維生素A醇及其它雜質(zhì)干擾的情況系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 測(cè)定重復(fù)性和分離度 固定相 硅膠流動(dòng)相 正己烷 正戊醇 997 3 照射 第二法 用于有雜質(zhì)的干擾的情況 步驟如下 1 皂化處理 皂化 乙醚提取 洗滌提取液 蒸發(fā)除乙醚 制備供試液A 2 凈化 供試液A經(jīng)液相色譜分離 準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液 制備成供試液B 固定相 ODS流動(dòng)相 甲醇 乙腈 水 50 50 2 3 含量測(cè)定 取供試液B按第一法測(cè)定 第三法 用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質(zhì)的干擾的情況1 制備供試液 取供試液A 凈化 水浴加熱 正已烷溶解 得供試液C 制備對(duì)照液 對(duì)照品儲(chǔ)備液 異辛烷溶解 稀釋 加熱 2 含量測(cè)定 在第一法的色譜條件下 交替精密進(jìn)樣 對(duì)照液和供試液 按外標(biāo)法定量 討論1 采用的是正相高效液相色譜法2 測(cè)定過程中應(yīng)避免VitD的氧化3 皂化應(yīng)劇烈振搖 水浴溫度 40 提取溶劑大多采用己烷或戊烷以消除苯的毒性4 若供試品中沒有VitA醇及其它雜質(zhì)干擾時(shí) 可以直接進(jìn)樣分析5 注意色譜系統(tǒng)適用性樣品VitD 前VitD的制備方法 一 結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 一 結(jié)構(gòu)維生素E為苯并二氫吡喃醇衍生物 苯環(huán)上有一個(gè)乙酰化的酚羥基 故又稱生育酚醋酸酯 有 和 四種異構(gòu)體 其中以 異構(gòu)體的生理作用最強(qiáng) 第五節(jié)維生素E的分析 dl 生育酚醋酸酯 二 性質(zhì)1 溶解性 微黃色或黃色透明的粘稠液體 易溶于乙醇 丙酮 乙醚 石油醚中 不溶于水2 具有紫外吸收 苯環(huán)上有酚羥基VE的0 lmg ml無水乙醇溶液在284nm波長處測(cè)定吸收度時(shí) 其吸收系數(shù)為41 0 45 0 3 易水解氧化 在無氧或其他氧化劑存在時(shí) 對(duì)熱穩(wěn)定 在有氧或其他氧化劑存在時(shí) 遇光 空氣可被氧化 二 鑒別試驗(yàn) 一 硝酸反應(yīng)原理 橙紅色 橙紅色 生育紅 HNO3 強(qiáng)氧化劑 二 三氯化鐵反應(yīng) 41 0 45 5 max 284nm min 254nm 0 01 無水乙醇中 薄層板硅膠G 展開劑環(huán)己烷 乙醚 4 1 顯色劑硫酸 105 5 結(jié)果各物質(zhì)的Rf值分別為 生育酚為0 5 生育酚醋酸酯為0 7 生育酮為0 9 四 TCL法 三 特殊雜質(zhì)1 酸度目的 制備過程引入的游離醋酸方法 以NaOH滴定液 0 1mol L 0 5ml 體積控制 2 游離生育酚的檢查原理 利用游離生育酚的還原性 用硫酸鈰滴定液 0 0lmol L 滴定 以二苯胺為指示劑 雜質(zhì)的限量為2 15 硫酸鈰滴定液 0 01mol L 二苯胺 亮黃 灰紫 二 試劑 M生育酚 430 8 取本品0 10g 加無水乙醇5ml溶解后 加二苯胺試液1滴 用硫酸鈰液 0 01mol L 滴定 消耗硫酸鈰液 0 01mol L 不得過1 0ml 2 15 藥典規(guī)定 消耗硫酸鈰液 0 01mol L 1 0ml 若硫酸鈰液濃度不是0 01mol L 應(yīng)重新計(jì)算硫酸鈰的消耗量 一 GC法 法定方法 GC特點(diǎn) 選擇性好靈敏度高速度快分離效能好 揮發(fā)性低 不穩(wěn)定 極性強(qiáng) 衍生化易受樣品蒸氣壓限制 中國藥典 2005年版 規(guī)定 VE的原料藥 片劑 注射劑 膠丸 粉劑等都采用氣相色譜法 1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)載氣 氮?dú)夤潭ㄏ?硅酮 OV I7 涂布于經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球上 涂布濃度為2 柱溫 265 進(jìn)樣口溫度高于柱溫30 50 檢測(cè)器 氫火焰離子化檢測(cè)器 柱效 理論塔板數(shù)按維生素E峰計(jì)算應(yīng)不低于500分離度 維生素E峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于22 校正因子測(cè)定內(nèi)標(biāo) 正三十二烷 加正己烷溶解稀釋成含1 0mg lml進(jìn)樣量 1 3 13 測(cè)定方法取1 3 1注入氣相色譜儀 測(cè)定 計(jì)算 即得 二 HPLC 用外標(biāo)法可以測(cè)定dl 生育酚1 色譜條件 色譜柱 內(nèi)徑4mm 長15 30Cm的不銹鋼柱 填充以粒徑5 l0 m的十八烷基硅烷鍵合硅膠固定相 流動(dòng)相 甲醇 水 49 1 紫外檢測(cè)器 波長為292nm 維生素E比醋酸維生素E先出峰 且二峰的分離度應(yīng)大于2 6 需做重現(xiàn)性試驗(yàn) 即重復(fù)試驗(yàn)3次 峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0 8 2 測(cè)定方法 取供試品液和對(duì)照品液各20 l注入高效液相色譜儀中 記錄峰高HX和Hr3 計(jì)算 供試品中維生素E的量mx mg 式中 mr 為生育酚對(duì)照品的量 Hx Hr 為生育酚供試品 對(duì)照品中檢測(cè)得峰高 三 熒光分光光度法 1 藥物本身具有熒光2 溶劑產(chǎn)生的拉曼光譜影響測(cè)定方法的靈敏度和準(zhǔn)確度3 采用同步熒光掃描法測(cè)定 消除干擾 同步熒光掃描法測(cè)定血清中VitE的含量 1 儀器 熒光分光光度計(jì)2 樣品液的制備 樣品測(cè)定管U 標(biāo)準(zhǔn)管S 空白管B3 測(cè)定方法 測(cè)定Fu Fs Fb4 計(jì)算 Discussion 激發(fā)波長295nm 發(fā)射波長325nm 普通熒光 同步熒光 選擇合適的波長差來消除溶劑的干擾 第六節(jié)復(fù)方制劑中多種維生素的分析 離子對(duì)HPLC法測(cè)定多種維生素 以能溶解于甲醇和水的樟腦磺酸為離子對(duì)試劑 以二巰基丙烷磺酸鈉為抗氧劑 采用HPLC法同時(shí)測(cè)定多種Vit的含量 1 色譜條件 色譜柱 流動(dòng)相 檢測(cè)波長2 樣品液的制備 水溶性Vit 配制內(nèi)標(biāo)苯酚IS 標(biāo)準(zhǔn)液 樣品液 脂溶性Vit 配制標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液 3 測(cè)定 水溶性測(cè)定波長272nm 脂溶性測(cè)定波長280nm4 計(jì)算外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法 習(xí)題 1 在三氯醋酸或鹽酸存在下 經(jīng)水解 脫羧 失水后 加入吡咯即產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物的藥物應(yīng)是A 氯氮卓B 維生素AC 普魯卡因D 鹽酸嗎啡E 維生素C 2 中國藥典采用以下何法測(cè)定維生素E含量A 酸堿滴定法B 氧化還原法C 紫外分光光度法D 氣相色譜法E 非水滴定法 3 中國藥典采用氣相色譜法測(cè)定維生素E含量 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為A 正二十二烷B 正二十六烷C 正三十烷D 正三十二烷E 正三十六烷 4 下列藥物的堿性溶液 加入鐵氰化鉀后 再加正丁醇 顯藍(lán)色熒光的是A 維生素AB 維生素B1C 維生素CD 維生素DE 維生素E 5 既具有酸性又具有還原性的藥物是A 維生素AB 咖啡因C 苯巴比妥D 氯丙嗪E 維生素C 6 維生素C的鑒別反應(yīng) 常采用的試劑有A 堿性酒石酸銅B 硝酸銀C 碘化鉍鉀D 乙酰丙酮E 三氯醋酸和吡咯 7 測(cè)定維生素C注射液的含量時(shí) 在操作過程中要加入丙酮 這是為了A 保持維生素C的穩(wěn)定B 增加維生素C的溶解度C 使反應(yīng)完全D 加快反應(yīng)速度E 消除注射液中抗氧劑的干擾 8 能發(fā)生硫色素特征反應(yīng)的藥物是A 維生素AB 維生素B1C 維生素CD 維生素EE 煙酸 9 維生素A的鑒別試驗(yàn)為A 三氯化鐵反應(yīng)B 硫酸銻反應(yīng)C 2 6 二氯靛酚反應(yīng)D 三氯化銻反應(yīng)E 間二硝基苯的堿性乙醇液反應(yīng) 10 維生素E的鑒別試驗(yàn)有A 硫色素反應(yīng)B 硝酸氧化呈色反應(yīng)C 硫酸 乙醇呈色反應(yīng)D 堿性水解后加三氯化鐵乙醇液與聯(lián)吡啶乙醇液呈色反應(yīng) 11 用三點(diǎn)校正法 三波長校正法 測(cè)定維生素醋酸酯含量時(shí) 采用未校正吸收度 實(shí)測(cè)值 計(jì)算含量 必須滿足以下條件 A在環(huán)己烷溶液中 最大吸收波長在326 329nm之間B在異丙醇溶液中 最大吸收波長在326 329nm之間C在各測(cè)定波長處的吸收度與328nm波長處的吸收度比值的規(guī)定值之差在 0 02 0 02之間D校正吸收度與未校正吸收度之差在未校正吸收度的 3 之間E校正吸收度與未校正吸收度之差在未校正吸收度 15 3 之間