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專題一 基因工程,1,,,考點一 基因工程的概念,基因拼接技術或DNA重組技術,生物體外,基因,DNA分子水平,人類需要的基因產物,剪切,→ 拼接,→ 導入,→ 表達,基因重組,2,3,4,考點二 基因工程的操作工具 1.限制性核酸內切酶——“分子手術刀” (1)來源: 主要是從原核生物中分離純化出來的。 (2)化學本質： 蛋白質。 (3)作用,催化作用,所以可重復利用,可用于DNA的切割獲取目的基因和 載體的切割,,5,(4)作用特點： 特異性,即限制酶可識別特定的脫氧核苷酸 序列,切割特定位點。 (5)切割方式,錯位切：產生兩個相同的黏性末端,平切：形成平末端,,6,提醒 ①切割的化學鍵為 。 ②在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶,目的是產生相同的黏性末端。 ③將一個基因從DNA分子上切割下來,需要個 限制酶,同時產生 個黏性末端。 ④不同DNA分子用同一種限制酶切割產生的黏性末端 ,同一個DNA分子用不同的限制酶產生的黏性末端 。,磷酸二酯鍵,2,4,相同,不相同,7,,,大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。,,限制酶,EcoRⅠ,限制性核酸內切酶,8,,,,限制酶,,,9,,,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。,10,11,,限制性核酸內切酶,12,◇特點：,限制性核酸內切酶,1、限制性 2、回文序列，常識別6（少4、5、8）核苷酸 系列 3、形成平末端或黏性末端,13,3’，5’-磷酸二酯鍵,14,,,,,A,,,,,A,,,,,T,,,,,T,,,,,G,,,,,C,,,,C,,,,,T,,,,,T,,,,,A,,,,,A,,,,,G,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,磷酸二脂鍵,15,基因的針線：DNA連接酶,16,2.DNA連接酶——“分子縫合針”,大腸桿菌,T4噬菌體,連接黏性末端,連接黏性末端 或平末端（效率低）,恢復被限制酶切開的兩個核苷酸 之間的磷酸二酯鍵,17,,,基因的針線——DNA連接酶,DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。,,,18,拓展提升 DNA連接酶與DNA聚合酶的比較,19,3.基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車” (1)類型 提醒 ①質粒本質是DNA,不是細胞器; ②特點:小型環(huán)狀。 (2)功能： 將目的基因導入受體細胞。,最常用載體:質粒,其他載體:λ噬菌體的衍生物、 動植物病毒等,,20,(3)應具備條件 ①能在宿主細胞內 ； ②有 限制酶的切割位點,以便于與外源基因連接； ③有特殊的 ,供重組DNA的檢測和鑒定。,穩(wěn)定保存并大量復制,一個至多個,遺傳標記基因,21,提醒 ①一般來說,天然載體往往不能滿足人類的所有要求,因此人們根據不同的目的和需要,對某些天然的載體進行人工改造。 ②常見的標記基因有抗生素基因、產生特定顏色的表達產物基因、發(fā)光基因等。 ③作為載體必須具有多個限制酶切點,而且每種酶的切點最好只有一個。因為某種限制酶只能識別單一切點,若載體上有一個以上的酶切點,則切割重組后可能丟失某些片段,若丟失的片段含復制起點區(qū),則進入受體細胞后便不能自主復制。一個載,22,體若只有某種限制酶的一個切點,則酶切后既能把環(huán)打開接納外源DNA片段,又不會丟失自己的片段。 ④注意與細胞膜上載體的區(qū)別,兩者的化學本質和作用都不相同。 ⑤質粒能自我復制,既可在自身細胞、受體細胞也可在體外復制。,23,運載體必需具備的條件： 1、有一個或多個限制酶切割位點， 2、能自我復制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA同步復制 3、帶有標記基因， 4、安全， 5、分子大小適合。,運載體,24,運載體,常用：質粒、噬菌體衍生物、動植物病毒,裸露、結構簡單、獨立， 自我復制、雙鏈環(huán)狀，DNA分子,25,26,27,2007天津理綜（14分）在培育轉基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作為標記基因，只有含卡那霉素抗性基因的細胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長。下圖為獲得抗蟲棉的技術流程。,28,請據圖回答： （1）A過程需要的酶有 （2）B過程及其結果體現了質粒作為運載體必須具備的兩個條件是 （3）C過程的培養(yǎng)基除含有必要營養(yǎng)物質、瓊脂和激素外，還必須加入,限制性核酸內切酶和DNA連接酶,具有標記基因；能在宿主細胞中復制并穩(wěn)定保存,卡那霉素,29,（4）如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進行檢測，D過程應該用________________ _____________________________作為探針。,放射性同位素（或熒光分子）標記的抗蟲基因,30,（5）科學家發(fā)現轉基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。 ①將轉基因植株與______________________雜交，其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數量比為1：1。 ②若該轉基因植株自交，則其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數量比為________。 ③若將該轉基因植株的花藥在卡那霉素培養(yǎng)基上作離體培養(yǎng)，則獲得的再生植株群體中抗卡那霉素型植株占_______%。,非轉基因植株,3：1,100,31,32,1．2 基因工程的基本操作程序,必修復習：,選修新課：,1、提取目的基因 2、與運載體結合 3、導入受體細胞 4、目的基因表達與檢測,1、獲取目的基因 2、構建表達載體 3、導入受體細胞 4、目的基因檢測與鑒定,四個步驟:,33,基因的結構（原核細胞）,非編碼區(qū)：不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質 。,編碼區(qū)：能夠轉錄為相應的信使RNA，進而指導蛋白質的合成，也就是說能夠編碼蛋白質 。,34,知識構建1：原核細胞的基因結構,結構,功能,編碼區(qū),能轉錄 并 蛋白質,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,非編碼區(qū),是 ， 起 作用,終止轉錄mRNA （終止子）,調控 的 表達,mRNA,編碼,RNA聚合酶結合位點,起動并催化轉錄,遺傳信息,35,,內含子:不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子，內含子能轉錄為信使RNA 。,外顯子:能夠編碼蛋白質的序列。,基因的結構（真核細胞）,36,,,,,,,,,轉 錄,mRNA前體,成熟mRNA,,,37,知識構建2：真核細胞的基因結構,結構,編碼區(qū),非編碼區(qū),內含子,外顯子,能夠 ，并 序列,能夠 ，不能 序列,（1）編碼區(qū)是 、 的 （2）在不同的基因中所含的 和 數目不同 （3）編碼區(qū) 占的比例小， 大部分由 組成,特點,有 序列,功能,轉錄RNA,編碼蛋白質,轉錄RNA,編碼蛋白質,間隔的,不連續(xù),外顯子,內含子,外顯子,內含子,調控遺傳信息的核苷酸,38,目的基因獲取方法,第一步：獲取目的基因,——主要指編碼蛋白質的結構基因，也可以是調控因子,方法：基因的直接分離或人工合成。 結果：獲取含有所需要的完整的遺傳信息的DNA片段。,1、從基因文庫中獲取 2、利用PCR技術擴增 3、化學合成法獲取目的 基因,39,基因庫(gene pool):特定生物體全部基因的集合. （天然存在）,基因組文庫（包含一種生物所有的基因） 部分基因文庫：如cDNA文庫（只含部分基因),根據構建方法的不同，基因文庫分為：,1、從基因文庫中獲取,基因文庫(gene library or gene bank):從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在.（人工構建）,40,,,,,,,,基因組文庫,cDNA文庫,41,圖為由mRNA反轉錄形成cDNA的過程,42,基因組文庫或cDNA文庫的比較,43,2、利用PCR技術擴增,(聚合酶鏈式反應),變性,復性 (退火),延伸,,,氫鍵打開，形成模板鏈,引物與DNA互補配對,DNA聚合酶作用使引物延伸,44,1,2,3,4,脫氧核苷酸,DNA聚合酶,,,,,,,,引物：人工合成的,與模板DNA上所要擴增的DNA片段的兩側序列互補，長度為20-25堿基的寡核苷酸單鏈。,45,PCR原理:DNA雙鏈復制,特點:1、體外復制 2、大量獲取目的基因（指數式增長） 3、原理和操作簡單,46,PCR擴增技術與DNA復制的比較,47,3、化學合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列,根據蛋白質的氨基酸順序推算出mRNA核苷酸順序，再據此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應的基因。,DNA合成儀,48,化學合成法:蛋白質 氨基酸序列 RNA堿基序列 DNA堿基序列 用4種脫氧核苷酸人工合成目的基因 反轉錄法:分離出供體細胞mRNA 單鏈DNA 合成目的基因,,49,第二步：基因表達載體的構建,——使目的基因能穩(wěn)定遺傳、表達發(fā)揮作用,啟動子：一段特殊結構的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位。,終止子：使轉錄停止。,標記基因：鑒定受體細胞是否含有目的基因，進行細胞篩選。,50,,基因表達載體的構建方法,51,,52,轉化的方法：,●導入植物細胞 ●導入動物細胞 ●導入微生物細胞,第三步 將目的基因導入受體細胞,53,1）導入植物細胞,農桿菌轉化法,特點：易感染雙子葉植物和裸子植物,可把Ti質粒上的T-DNA轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上.,54,55,2) 導入動物細胞,顯微注射技術,用口徑為1 μm的DNA注射器，將大量的目的基因片段注入到受精卵的核內，然后把經過注射的受精卵移植到另一雌性動物的子宮內，使受精卵發(fā)育為轉基因動物。,56,,57,原核生物的特點:繁殖快、單細胞、遺傳物質少,3) 導入微生物細胞,大腸桿菌轉化過程,①將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。 ②使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。 ③目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非?？欤诤芏痰臅r間內就能獲得大量的目的基因。,58,常用的受體細胞：,大腸桿菌、枯草桿菌、農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。,將目的基因導入受體細胞的原理,借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。,59,將目的基因導入受體細胞,60,提醒 ①唯一不涉及到堿基互補配對的操作步驟。 ②微生物做受體細胞主要是個體微小,代謝旺盛,繁殖速度快,獲得目的基因產物多。 ③植物細胞還可用基因槍法和花粉管通道法。,61,第四步 目的基因的檢測和表達,,62,第四步：目的基因的檢測與鑒定,DNA分子雜交技術,63,核酸分子雜交 實質上是用已知序列的DNA或RNA片段作為探針與待測樣品的DNA或RNA序列進行核酸分子雜交。是基因診斷最基本的技術之一。 分子探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。 滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標記物。,64,探針 (probe)：一小段用同位素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,標記物 同位素標記：32P 非放射性標記：熒光標記，生物素，dig(地高辛）等,65,生物芯片,從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。 通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。 基因芯片診斷技術以其快速、高效、敏感、經濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現代化診斷新技術。,66,1、檢測轉基因生物的染色體DNA上的目的基因 2、檢測目的基因是否轉錄mRNA 3、檢測目的基因是否翻譯蛋白質,檢測,鑒定,個體生物學水平鑒定 （如抗蟲、抗病鑒定，基因工程產品與天然產品功能進行活性比較等）,67,大量的受體細胞接受不多的目的基因。處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。 將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產物。淘汰無表達產物的菌落，保留有表達產物的進一步培養(yǎng)、研究。,,68,69,以 質 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程,70,克隆(clone) 通過無性繁殖獲得來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。而獲取此同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)。,DNA克隆,技術水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 細胞克隆 個體克隆（動物或植物）,71,DNA克隆 應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。,72,