《高二生物質疑解惑課件：5-2《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》（人教版選修I）》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《高二生物質疑解惑課件：5-2《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》（人教版選修I）（39頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

歡迎進入生物課堂 課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段 課程標準嘗試PCR技術的基本操作和應用 課標解讀1 理解PCR技術的基本原理 2 知道PCR技術的基本操作過程 3 討論PCR技術的應用 1 生物體內DNA分子復制的條件 1 四種是合成子鏈的原料 2 提供了DNA復制的模板 3 打開了DNA雙鏈 4 催化合成DNA子鏈 5 使DNA聚合酶能夠從開始連接脫氧核苷酸 PCR技術的原理及反應過程 脫氧核苷酸 DNA母鏈 解旋酶 DNA聚合酶 引物 引物的3 端 2 PCR擴增的原理及條件 1 概念PCR即 是一種迅速的技術 它能以極少量的為模板 在短時間內復制出上百萬份的 2 原理 DNA的熱變性 在的溫度范圍內 DNA雙螺旋結構解體 雙鏈分開 這個過程稱為 當溫度緩慢后 兩條彼此分離的DNA鏈又會重新 子鏈的合成 a 需要 b 合成方向總是從子鏈的端向端延伸 多聚酶鏈式反應 體外 擴增DNA片段 DNA DNA拷貝 80 100 變性 降低 結合成雙鏈 引物 5 3 3 條件 模板 分別與模板DNA兩條模板鏈相結合的兩種 A T G C四種 耐熱DNA聚合酶 一般用 需要一定的和能嚴格控制的溫控設備 DNA 引物 脫氧核苷酸 耐高溫的TaqDNA聚合酶 緩沖溶液 溫度 3 PCR反應過程PCR一般要經歷次循環(huán) 每次循環(huán)可以分為 和三步 1 當溫度上升到以上時 雙鏈DNA解聚為單鏈 2 溫度下降到左右 通過與兩條單鏈DNA結合 3 溫度上升到左右 溶液中的四種脫氧核苷酸在的作用下 根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈 三十多 變性 復性 延伸 變性 90 復性 50 兩種引物 堿基互補配對 延伸 72 DNA聚合酶 思維激活1 DNA復制緣何必須有引物 提示DNA聚合酶不能從頭合成DNA 而只能以3 延伸DNA鏈 故DNA合成時 必須加入引物 其3 游離 以作為延長DNA子鏈的 引子 1 細胞內DNA復制和細胞外PCR擴增的比較 見下表 2 PCR過程 1 變性當溫度上升到90 以上時 雙鏈DNA解聚為單鏈 2 復性溫度下降到50 左右 兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合 3 延伸溫度上升到72 左右 溶液中的四種脫氧核苷酸 A T C G 在DNA聚合酶的作用下 根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈 特別提醒 1 72 左右時 TaqDNA聚合酶有最大活性 可使DNA新鏈由5 端向3 端延伸 2 DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列 使該段固定長度的序列呈 指數式 擴增 鞏固1 標準的PCR過程一般分為變性 復性 延伸三大步 這三大步需要的溫度依次是 A 94 55 72 B 72 55 94 C 55 94 72 D 80 55 72 解析當溫度上升到90 90 96 以上時 雙鏈DNA解聚為單鏈 稱之為變性 當溫度下降到50 40 60 左右時 兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合 當溫度上升到72 70 75 時 溶液中的四種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下 根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈 稱為延伸 答案A 1 實驗用具 1 PCR儀 該儀器能自動調控 實現DNA的擴增 如果沒有PCR儀 可用3個代替 操作時按程序在3個中PCR反應的微量離心管 2 微量離心管 總容積為 實際上是進行的場所 3 微量移液器 用于 PCR技術的實驗操作及評價 溫度 恒溫水浴鍋 水浴鍋 來回轉移 0 5mL 多聚酶鏈式反應 轉移PCR配方中的液體 2 操作步驟準備 混合 反應 3 操作提示 1 為避免等因素的污染 實驗中使用的一些用具在使用前必須進行 2 所用的和應分裝成小份 并在儲存 3 在中添加反應成分時 每吸取一種試劑后 移液器上的槍頭必須 加入組分 設置PCR的循環(huán)程序 外源DNA 高壓滅菌 緩沖液 酶 20 微量離心管 更換 思維激活2 PCR操作中模板DNA是否需解旋 需要旋轉酶嗎 提示PCR操作中 模板DNA仍需解旋 但該解旋過程不是DNA解旋酶催化的結果 而是利用DNA熱變性的原理 在80 100 溫度范圍內 DNA雙螺旋結構將解體 雙鏈分開 以此達到解旋的目的 1 PCR儀 PCR自動化程度較高 參照下表設計程序即可 將微量離心管放在離心機上 離心約10s 目的是使反應液集中在離心管底部 3 實驗中DNA含量的測定DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰 峰值的大小與DNA的含量有關 可以利用DNA這一特點進行DNA含量的測定 具體方法如下 稀釋 2 LPCR反應液 加入98 L蒸餾水 即將樣品進行50倍稀釋 對照調零 以蒸餾水作為空白對照 在波長260nm處 將紫外分光光度計的讀數調節(jié)至零 測定 取DNA稀釋液100 L至比色杯中 測定260nm處的光吸收值 計算 DNA含量 g 50 260nm的讀數 稀釋倍數特別提醒若沒有PCR儀 可進行水浴擴增DNA設置3個恒溫水浴鍋 溫度分別為94 55 和72 在3個水浴鍋中依據PCR儀的處理時間來回轉移PCR反應的微量離心管即可 鞏固2 聚合酶鏈式反應 PCR技術 是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法 由高溫變性 低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期 循環(huán)進行 使目的DNA得以迅速擴增 其簡要過程如圖所示 下列關于PCR技術敘述不正確的是 A PCR技術是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術B 反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板C PCR技術中以核糖核苷酸為原料 以指數方式擴增D 應用PCR技術與探針雜交技術可以檢測基因突變 解析PCR技術是人工合成DNA的方法 原料是脫氧核苷酸而不是核糖核苷酸 答案C 例1 2011江蘇 請回答有關問題 1 利用PCR技術擴增目的基因 其原理與細胞內DNA復制類似 如下圖所示 圖中引物為單鏈DNA片段 它是子鏈合成延伸的基礎 PCR技術的原理 從理論上推測 第四輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為 在第 輪循環(huán)產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段 2 設計引物是PCR技術關鍵步驟之一 某同學設計的兩組引物 只標注了部分堿基序列 都不合理 如下圖 請分別說明理由 第1組 第2組 3 PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶 下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能 這是因為 思維導圖 歸納提升 PCR技術特點 1 PCR不需要解旋酶 而生物體內DNA復制時需要解旋酶 2 PCR需要耐熱的DNA聚合酶 而生物體內DNA聚合酶在高溫時會變性 3 PCR一般需經三十多次循環(huán) 而生物體內DNA復制需要生物體自身的控制 例2 使用PCR儀具體實驗操作順序應為 設計好PCR儀的循環(huán)程序 按配方準備好各組分 用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分 進行PCR反應 離心使反應液集中在離心管底部A B C D 思維導圖 PCR技術實驗操作及注意事項 深度剖析PCR反應的操作步驟一般分為準備 包括配制配方及將各配方放于實驗臺上 移液 混合 離心 反應 因PCR儀是一種自動控制溫度的儀器 設計好循環(huán)程序就可以進行反應了 答案C 單擊此處進入隨堂達標檢測 教材P631 提示繪圖可參考教科書中圖5 9 PCR反應中的DNA片段一般以2n的方式積累 其中n為反應循環(huán)次數 一個DNA片段在30次循環(huán)后反應物中大約有10億個這樣的片段 2n 230 1073741824 解析PCR擴增DNA片段可以使目的片段呈指數增長 2 提示根據已知DNA序列設計引物 因為PCR擴增的是兩種引物之間的特定DNA序列 解析PCR引物是根據需要擴增的目標DNA的堿基序列來設計的 引物的設計需要豐富的分子生物學實踐的經驗 同學們 來學校和回家的路上要注意安全 同學們 來學校和回家的路上要注意安全